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        miR-30b和miR-30d對胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8/SVneo遷移能力的影響

        2020-11-19 05:02:08仲玉霞
        實(shí)用醫(yī)藥雜志 2020年11期
        關(guān)鍵詞:滋養(yǎng)層胎盤質(zhì)粒

        仲玉霞

        子癇前期(preeclampsia,PE)是常見的妊娠相關(guān)疾病,全球發(fā)病率為3%~5%[1]。PE發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確,有研究認(rèn)為其與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖凋亡異常、浸潤能力不足等相關(guān)[2]。miRNA是指非編碼的小分子RNA,在多種生理過程中發(fā)揮重要作用,且多種miRNA的異常表達(dá)可能與PE的發(fā)病相關(guān)[3]。 miR-30b 和 miR-30d 是 miR-30 的家族成員,研究發(fā)現(xiàn)二者在小鼠PE胎盤組織中表達(dá)異常,可能與PE的發(fā)病有關(guān)[4]。筆者檢測miR-30b和miR-30d在人胎盤組織中的表達(dá)及其在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中的含量,并通過干預(yù)其表達(dá),分析其對滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移能力的影響。

        1 材料與方法

        1.1 樣本收集 選取2016年6月—2018年1月在筆者所在醫(yī)院分娩的10例子癇前期產(chǎn)婦為PE組,年齡(29.7±3.9)歲。 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合 PE 診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)分娩孕周≥28 周;(3)單胎;(4)無原發(fā)性糖尿病、高血壓、冠心病等內(nèi)外科并發(fā)癥。PE組排除標(biāo)準(zhǔn):(1)排除自發(fā)性流產(chǎn)或?qū)m內(nèi)死胎;(2)胎兒先天性疾病,染色體異常;(3)通過輔助生殖技術(shù)而懷孕。10例正常足月分娩的產(chǎn)婦作為對照組,年齡(29.4±3.8)歲;兩組產(chǎn)婦均對該研究知情同意,且研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。收集兩組產(chǎn)婦分娩后的胎盤組織:胎盤娩出15 min內(nèi)剪取胎盤母體面中央近臍帶根部胎盤組織4 cm3,避開壞死部位、鈣化點(diǎn)等部位,清洗后立即放置于液氮中,-80℃冰箱保存,用于批量檢測。

        1.2 細(xì)胞及主要試劑 人永生化滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫,10%胎牛血清, 青霉素 (100 μg/ml), 鏈霉素 (100 μg/ml),RPMI1640(100 μg/ml)培養(yǎng)基購自生物工程(上海)股份有限公司。miR-30b mimic、miR-30b mimic對照質(zhì)粒 (mimic-NC),miR-30d inhibitor、miR-30d inhibitor對照質(zhì)粒(inhibitor-NC)購自 Genecopoeia公司。

        1.3 PCR檢測miR-30b和miR-30d在胎盤組織中的表達(dá) 采用RT-PCR檢測胎盤組織中miR-30b和miR-30d的表達(dá)。

        反應(yīng)條件為:95℃10min,95℃15s,72℃15s,共358個(gè)循環(huán)。U6作為miR-30b和miR-30d的內(nèi)參,所有引物購自上海生工,引物如下:

        miR-30b 上游引物:5’-ACACTCCAGCTGGGC TGGGATGTGGATG-3’,

        下游引物:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’;

        miR-30d 上游引物:5’-AACCTGAGTGGAGC AGA-3’,

        下游引物:5’-TGTAAACATCCCCGAC-3’;

        內(nèi)參 U6上游引物:5’-CTTCGGCACCACATA TACTAAAT-3’,

        下游引物:5’-CAGGGGCCATGCTAAATCTTC-3’。 用 2-ΔΔCt法計(jì)算 mRNA 表達(dá)的倍數(shù)。

        1.4 過表達(dá)miR-30b和抑制miR-30d對HTR8/SVneo細(xì)胞遷移能力的影響 將細(xì)胞分為miR-30b-mimic組和mimic-NC組、miR-30d inhibitor和inhibitor-NC組,分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒;同時(shí)設(shè)置空白對照組(Blank)。RT-PCR檢測各組細(xì)胞中miR-30b和miR-30d的水平以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。Transwell檢測各組細(xì)胞的遷移能力:細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30b和miR-30d 24 h后,進(jìn)行胰酶消化,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。清洗細(xì)胞,并用無血清培養(yǎng)基重懸,取 200 μl(含 1×105個(gè)細(xì)胞)細(xì)胞培養(yǎng)在 Transwell小室中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,用棉簽拭去Transwell小室未遷移過底膜的細(xì)胞,用-20℃預(yù)冷的甲醇固定遷移過小室底膜的下部細(xì)胞,約10 min,用蘇木素染色10 min,用蒸餾水浸洗,200倍顯微鏡下挑選9個(gè)不同視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用()表示,兩組間行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 miR-30b和miR-30d在胎盤組織中的表達(dá)RT-PCR結(jié)果如表1所示,與對照組相比,PE組胎盤組織中miR-30b相對表達(dá)量顯著升高,miR-30d相對表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        表1 兩組miR-30b和miR-30d表達(dá)水平比較()

        表1 兩組miR-30b和miR-30d表達(dá)水平比較()

        組別 n miR-30b miR-30d對照組 10 0.76±0.25 0.90±0.23 PE 組 10 1.32±0.48 0.65±0.26 t值 - 3.272 2.277 P值 - 0.004 0.035

        2.2 miR-30b和miR-30d對細(xì)胞遷移能力的影響

        2.2.1 PCR檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后,RT-PCR檢測結(jié)果顯示 (圖1):與Blank和mimic-NC組相比,miR-30b-mimic組miR-30b表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與Blank和inhibitor-NC組相比,miR-30d inhibitor組miR-30d表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        2.2.2 Transwell檢測各組細(xì)胞遷移能力變化 如圖2所示,轉(zhuǎn)染24 h后,與Blank組、mimic-NC、inhibitor-NC相比,miR-30b-mimic組和 miR-30d inhibitor組的細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少(P<0.05),提示細(xì)胞遷移能力降低。

        圖2見封三。

        3 討論

        圖1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后各組細(xì)胞中miR-30b和miR-30d的相對含量

        PE是由多種因素導(dǎo)致的妊娠期特異性疾病,臨床表現(xiàn)為蛋白尿、高血壓等,并伴有常見并發(fā)癥,病情嚴(yán)重情況下可危及母嬰生命[5],且PE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,研究尚無統(tǒng)一結(jié)論[6]。大部分研究認(rèn)為胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、分化、浸潤、凋亡等功能異??梢鹛ケP血管重塑障礙,致使胎盤組織缺血缺氧,最終導(dǎo)致PE發(fā)生[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn),在不良生長的胎盤及滋養(yǎng)層細(xì)胞中存在多種異常表達(dá)的miRNAs,可能參與 PE 的發(fā)生發(fā)展[8]。Lu 等[9]研究發(fā)現(xiàn),miR-137可通過調(diào)節(jié)雌激素受體相關(guān)受體作用于胎盤滋養(yǎng)型細(xì)胞的增殖和遷移。Ji等[10]研究表明,PE患者胎盤組織中miR-136呈現(xiàn)高表達(dá),通過影響間充質(zhì)干細(xì)胞和血管生成促進(jìn)PE的生成。 Ding 等[11]研究發(fā)現(xiàn),miR-128a 可誘導(dǎo) HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡促進(jìn)PE發(fā)生。另有研究指出,子癇前期產(chǎn)婦胎盤組織存在miR-30b表達(dá)升高,miR-30d表達(dá)降低[12]。動物研究發(fā)現(xiàn)miR-30b在孕鼠的胎盤組織中呈顯著性高表達(dá),以多種途徑參與調(diào)控胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移侵襲等功能[13]。目前關(guān)于miR-30家族與PE相關(guān)性的研究較少,其機(jī)制仍不明確。該研究結(jié)果提示miR-30b和miR-30d的異常表達(dá)可能參與PE的發(fā)生發(fā)展?,F(xiàn)有研究顯示,滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲能力不足,子宮螺旋動脈重塑障礙導(dǎo)致胎盤灌注不足是引起PE特征性病理變化的主要原因,也是PE發(fā)病的關(guān)鍵因素[14]。為驗(yàn)證miR-30b、miR-30d與PE相關(guān)性并探討其機(jī)制,筆者進(jìn)一步進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以探討其與細(xì)胞遷移能力的相關(guān)性。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒分別上調(diào)HTR-8/SVneo細(xì)胞中miR-30b水平和下調(diào)miR-30d水平后,細(xì)胞遷移能力顯著降低(P<0.05),提示miR-30b過表達(dá)和miR-30d低表達(dá)可抑制滋養(yǎng)層HTR8/SVneo細(xì)胞的遷移能力。因此可以推測,miR-30b上調(diào)及miR-30d下調(diào)與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移能力呈負(fù)相關(guān),當(dāng)其在胎盤組織中異常表達(dá)時(shí),可能導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤能力不足,從而導(dǎo)致血管重塑障礙促進(jìn)PE的發(fā)生和進(jìn)展。但其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制還不明確,尚需進(jìn)一步研究。

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