余 科，安 苗，黃 勝，潘秋芝，聶福順，何孝寬

( 1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.平塘縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 黔南州 558300； 3.荔波縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 黔南州 558400 )

貴州境內(nèi)苗嶺山脈系動物地理區(qū)劃的分界線，其位于長江和珠江的上游，橫貫中部的苗嶺山脈把全境劃分為北面的長江流域和南面的珠江流域，屬動物區(qū)劃中的南亞亞區(qū)和南東亞亞區(qū)[7]，華西小區(qū)、華南小區(qū)和華東小區(qū)的交替地帶[8-9]，是魚類遺傳結(jié)構(gòu)及其多樣性比較研究的理想場所。錦江屬于山脈北面長江流域中沅江支流辰水上源，平舟河與樟江分別屬于南面珠江流域中西江支流和柳江支流。在各大河流中長江和珠江上游相互交錯的區(qū)間河流十分復(fù)雜，各水系中中國少鱗鱖的比較研究較少，不利于全面認(rèn)識2大流域種群間的遺傳多樣性及其系統(tǒng)進化關(guān)系，特別是對苗嶺山脈兩側(cè)群體的研究尚未見報道。對此筆者利用線粒體Cytb基因和D-Loop控制區(qū)聯(lián)合測序分析的方法[10-17]，從分子水平揭示了2大流域中3個地理亞群間中國少鱗鱖的遺傳變異，并將其與同流域不同水系間種群進行比較，不僅豐富了種群的遺傳背景資料，而且為魚類的保護和優(yōu)良種質(zhì)資源挖掘利用提供理論依據(jù)[18]。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本試驗中86尾中國少鱗鱖均為野生活魚。其中采自沅江上游銅仁錦江31尾(錦江群體)，平塘縣平舟河43尾(平舟河群體)，荔波縣樟江12尾(樟江群體)。活魚解剖取其背部肌肉3～5 g于無水乙醇中浸泡，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?，?biāo)本魚編號后浸泡于5%甲醛溶液中，保存在貴州大學(xué)水產(chǎn)系標(biāo)本室待測。

1.2 提取DNA

利用DNA提取試劑盒(北京天根)提取樣品肌肉基因組DNA，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗其完整性，再利用紫外分光光度計(Thermo Nano Drop 2000C)測定其吸光值。最后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物的篩選與PCR的擴增

參照擴增線粒體Cytb基因序列[19]和D-Loop區(qū)段[20]的引物，對本試驗中86個中國少鱗鱖樣品進行擴增。Cytb引物序列為：CW03F，5′-CATAGGTCATAATTCCTGC-3′；CW04R，5′-GAATCC-TAGCTTTGGGA-3′。D-Loop區(qū)段引物序列為：Telpro，5′-ATTCCACCTCTAACTCCCAAAGCT-AG-3′；Telphe，5′-CGTCGGATCCCATCTTCAG-TGTTATGCTT-3′。送至上海生工生物工程股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系均為25 μL，其中Mix 12.5 μL，上下游引物各1.25 μL，DNA 2.5 μL，剩余體積用雙蒸水補齊。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，51.2 ℃退火(Cytb)或58.6 ℃退火(D-Loop)40 s，72 ℃延伸50 s，重復(fù)35個循環(huán)；最后再72 ℃終延伸7 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，選擇特異性強的樣品送至上海生工生物工程有限公司進行雙向測序。

1.4 序列分析

測定的上下游序列利用DNA Star 5.0軟件包中的SeqMan進行拼接并手工校對。并從美國國立生物技術(shù)信息中心下載目的序列，利用MEGA 6.06軟件進行一致比對，保留相同序列長度。以花鱸(Lateolabraxmaculatus)(NC029318)為外群，結(jié)合美國國立生物技術(shù)信息中心基因庫中各水系不同群體單倍型：辰水河中國少鱗鱖(JN315600)、舞水中國少鱗鱖(JN315582)、漠陽江中國少鱗鱖(JN315563、JN315561)、廣西中國少鱗鱖(AB108488)、澄家江中國少鱗鱖(JN315579、JN315577)、北江中國少鱗鱖(JN315571、JN35564)、日本少鱗鱖(C.kawamebari)(NC009868、AP005990)以及朝鮮少鱗鱖(C.herzi)(NC027164、KR075132)等與本試驗中序列比對一致，運用MEGA 6.06統(tǒng)計其堿基組成及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹其節(jié)點的自舉置信度水平由自引導(dǎo)值估計，重復(fù)次數(shù)為1000；基于Kimura-2-parameter模型計算遺傳距離。運用Arlequin 3.5進行差異性分子方差顯著性檢驗和計算種群間遺傳分化指數(shù) (FST)。最后再通過DNASP 5.0軟件獲得群體序列遺傳多樣性參數(shù)，包括單倍型數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)，基因流(Nm)由Nm≈(1-FST)/4FST計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA Cytb和D-Loop區(qū)堿基序列組成

利用上述引物對中國少鱗鱖的86個樣品進行擴增。經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)序列比對剪切后，保留序列長度為1141 bp(Cytb)和822 bp(D-Loop)的同源序列。基于Cytb基因序列中，共界定出18種單倍型，這3個種群中不存在共享單倍型，均為各自群體所獨有。在堿基組成方面，檢測出11個變異位點，無插入和缺失，變異率占0.96%。其中存在1個顛換和10個轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在堿基T與C之間，轉(zhuǎn)換與顛換比為6.195?；贒-Loop基因序列中，共界定出23種單倍型，同樣不存在共享單倍型。在堿基組成方面，檢測出17個變異位點，其中存在2個缺失和3個插入，變異率占2.07%。其中存在5個顛換和12個轉(zhuǎn)換，A與G轉(zhuǎn)換的位點數(shù)占總變異的41.1%，略高于T與C轉(zhuǎn)換比29.4%，轉(zhuǎn)換與顛換比為5.21，這符合脊椎動物 DNA 堿基變異位點中轉(zhuǎn)換大于顛換的觀點。

2.2 基于mtDNA Cytb和D-Loop基因的遺傳多樣性結(jié)果

通過對中國少鱗鱖3個種群Cytb基因序列的分析，錦江群體存在10個變異位點，平舟河群體存在6個變異位點，而樟江群體僅存2個變異位點。3個中國少鱗鱖群體的單倍型多樣性、平均核苷酸差異數(shù)、核苷酸多樣性分別為0.918、3.342、0.00293。在D-Loop基因序列中，錦江群體存在9個變異位點，平舟河群體存在4個變異位點，而樟江群體僅存5個變異位點。3個中國少鱗鱖群體的單倍型多樣性、平均核苷酸差異數(shù)、核苷酸多樣性分別為0.903、3.343、0.00410。通過比較2段基因序列的群體間多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，錦江群體的遺傳多樣性較為豐富(表2)。而基于mtDNA Cytb和D-Loop基因的3個中國少鱗鱖種群間遺傳分化指數(shù)均>0.25，達到極顯著水平(P<0.001)，表明群體間分化極顯著(表3)。

表1 基于mtDNA Cytb和D-Loop序列的堿基組成Tab.1 Base composition based on mtDNA Cytb and D-Loop sequences

表2 基于mtDNA Cytb和D-Loop(括號內(nèi))序列的遺傳多樣性指數(shù)和中性檢驗Tab.2 Genetic diversity index and neutral test based on mtDNACytb and D-Loop (within parentheses)

表3 基于mtDNA Cytb和D-Loop(括號內(nèi))序列3個種群間的遺傳分化、基因流和遺傳距離指數(shù)Tab.3 Genetic differentiation, gene flow and genetic distance index among the three populations based on mtDNA Cytb and D-Loop (within parentheses) sequences

2.3 基于mtDNA Cytb和D-Loop基因分子方差分析

將3個群體按水系分成2組: 第1組為長江流域沅江水系的錦江群體，第2組為珠江流域柳江水系的平舟河群體和樟江群體。在Cytb基因序列分析中，水系間變異占27.77%，水系內(nèi)群體間變異為32.42%，群體內(nèi)個體間變異占39.81%(FCT=0.27768，F(xiàn)SC=0.44887，F(xiàn)ST=0.60191)，說明這3個群體間遺傳變異主要來源于群體內(nèi)個體間，其次才是水系和群體間。而基于對D-Loop區(qū)段的分析中，兩水系間的變異占15.51%，水系內(nèi)群體間變異為46.21%，群體內(nèi)個體間變異占38.28%(FCT=0.15508，F(xiàn)SC=0.54689，F(xiàn)ST=0.61716)，其遺傳變異最主要來源是水系內(nèi)種群間，即平舟河群體和樟江群體間，其次來源于水系間和群體內(nèi)個體間(表4)。

表4 基于mtDNA Cytb和D-Loop(括號內(nèi))序列的分子方差分析Tab.4 Analysis of molecular variance (AMOVA) based on mtDNA Cytb and D-Loop in parentheses

2.4 中國少鱗鱖Cytb基因序列遺傳結(jié)構(gòu)

對中國少鱗鱖Cytb基因進行擴增，通過比對保留了1141 bp長度，共編碼了380個氨基酸。由于堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換，有可能造成氨基酸的改變。本試驗中，在118nt、716nt、725nt、824nt、887nt和1079nt處均因堿基的改變，其氨基酸也發(fā)生了相應(yīng)的變化。在118nt處，堿基T轉(zhuǎn)換為C，導(dǎo)致氨基酸由酪氨酸(Y)變?yōu)榻M氨酸(H)；716nt處，堿基C轉(zhuǎn)換為T，導(dǎo)致氨基酸由脯氨酸(P)變?yōu)榱涟彼?L)；725nt處，堿基G轉(zhuǎn)換為A，導(dǎo)致氨基酸由精氨酸(R)變?yōu)橘嚢彼?K)；824nt處，堿基C轉(zhuǎn)換為T，導(dǎo)致氨基酸由蘇氨酸(T)變?yōu)榧琢虬彼?M)；887nt處，堿基A轉(zhuǎn)換為G，導(dǎo)致氨基酸由絲氨酸(H)變?yōu)榫彼?R)；1079nt處，堿基A轉(zhuǎn)換為G，導(dǎo)致氨基酸由谷氨酸(E)變?yōu)楦拾彼?G)。這些位點均因轉(zhuǎn)換而導(dǎo)致氨基酸的改變。

2.5 基于mtDNA Cytb和D-Loop 基因的種群動態(tài)變化

各種群的Fu′sFs值均未表現(xiàn)出顯著的負(fù)值。而在堿基錯配圖中(圖1)，因樟江群體的變異位點較少，信息量少，種群擴張不宜采納。為此，將3個種群按2大水系分為2類，長江流域中錦江河段呈多峰的趨勢，珠江流域2大種群合在一起呈單峰的趨勢。基于Cytb序列3個群體的分析圖中，呈現(xiàn)出單峰的趨勢，而基于D-Loop序列中則呈現(xiàn)多峰的趨勢。

圖1 基于mtDNA Cytb和D-Loop基因3個種群核苷酸不匹配分析Fig.1 Nucleotide mismatch analysis in the three populations based on mtDNA Cytb and D-Loop genesa.錦江群體Cytb序列; b.平舟河與樟江群體Cytb序列; c.3個群體Cytb序列; d.錦江群體D-Loop序列; e.平舟河與樟江群體D-Loop序列; f.3個群體D-Loop序列.a.Cytb sequence in Jinjiang River population; b.Cytb sequence in Pingzhou River and Zhangjiang River populations; c.Cytb sequence in the three populations; d.D-Loop sequence in Jinjiang River population; e.D-Loop sequence in Pingzhou River and Zhangjiang River populations; f.D-Loop sequence in the three populations.

2.6 構(gòu)建鄰接系統(tǒng)進化樹

由系統(tǒng)進化樹的結(jié)果(圖2)可知，中國少鱗鱖顯示出2個譜系，本試驗中18個單倍型與舞水、辰水群體構(gòu)成了譜系1，且Hap11與另外17個單倍型形成支持率很高的亞枝；而北江、澄家江和漠陽江群體構(gòu)成了苗嶺山脈以南的譜系2，且置信度100%。譜系1中發(fā)現(xiàn)，長江流域的錦江群體和珠江流域中柳江和西江水系群體聚類在一起，并且這 3個種群的單倍型聚類未能與當(dāng)下河流水系對應(yīng)形成明顯的系統(tǒng)地理學(xué)關(guān)系。

圖2 基于線粒體Cytb序列構(gòu)建鄰接系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 NJ phylogenetic tree based on mtDNA Cytb sequence

3 討 論

3.1 Cytb和D-Loop兩區(qū)段中的堿基組成

本試驗獲得的D-loop和Cytb基因同源片段序列中，A+T含量均高于G+C含量。這與其他魚類線粒體DNA堿基組成相同[21-23]，符合動物線粒體基因組中4種核苷酸不均一分布這一共性[24]。并且在Cytb同源序列中，堿基C表現(xiàn)出偏歧性和呈現(xiàn)出對堿基G的偏好性；而在D-Loop區(qū)段內(nèi)，A+T含量(64%)遠大于 G+C含量(36%)，明顯表現(xiàn)出對堿基AT的偏好性和反G的偏歧。在大瀧六線魚(Hexagrammosotakii)群體遺傳多樣性的結(jié)果分析中，也存在堿基A、T明顯高于堿基G、C的情況，說明這是脊椎動物D-Loop區(qū)段的特征[25]。在Cytb區(qū)段中存在11個變異位點，共界定了18種單倍型，這兩項指標(biāo)均低于D-Loop區(qū)中變異位點數(shù)(17個)和單倍型個數(shù)(23種)。這很可能是由于在線粒體基因中，D-Loop區(qū)段為非編碼區(qū)，不編碼蛋白質(zhì)，受自然選擇的壓力小，且變異速度也是最快而產(chǎn)生的差異[26-27]。不僅如此，在該非編碼區(qū)還發(fā)現(xiàn)3個插入和2個缺失，這可能是該區(qū)段不受蛋白功能需要和三聯(lián)體密碼限制，插入和缺失位點突變后比較容易保留。而Cytb用于編碼蛋白質(zhì)，帶有插入和缺失突變的個體很容易被淘汰[21]。

3.2 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性就是基因的多樣性，而基因多樣性就是基因變異的差異大小，即遺傳多樣性最直接的表達形式就是遺傳變異程度。由遺傳物質(zhì)變異積累產(chǎn)生的遺傳多樣性決定物種的適應(yīng)能力及進化趨勢，也是種質(zhì)資源保護和利用的前提和基礎(chǔ)。而我們通常以單倍型多樣性和核苷酸多樣性來評價遺傳多樣性[28]。遺傳多樣性越豐富，物種對環(huán)境變化的適應(yīng)能力和進化能力越強[29]。Grant等[10]基于整個mtDNA限制性內(nèi)切酶的結(jié)果，將魚類遺傳多樣性分為：低單倍型多樣性低核苷酸多樣性(單倍型多樣性<0.5,核苷酸多樣性<0.005)、低單倍型多樣性高核苷酸多樣性(單倍型多樣性<0.5,核苷酸多樣性>0.005)、高單倍型多樣性低核苷酸多樣性(單倍型多樣性>0.5,核苷酸多樣性<0.005)和高單倍型多樣性高核苷酸多樣性(單倍型多樣性>0.5,核苷酸多樣性>0.005)4種情形。依據(jù)該劃分標(biāo)準(zhǔn)，通過Cytb和D-Loop兩區(qū)段對3個群體多樣性程度進行分析，錦江群體與平舟河群體均呈高單倍型多樣性低核苷酸多樣性類型，而樟江群體呈現(xiàn)出低單倍型多樣性低核苷酸多樣性類型。司從利[30]認(rèn)為，珠江水系鱖魚呈現(xiàn)高單倍型多樣性低核苷酸多樣性的特點，可能是因為冰期破壞了鱖魚棲息地，種群數(shù)量下降，此類型種群通常由一個較小的有效種群經(jīng)過近期快速擴張形成一個大的種群所致。這種快速群體擴張可產(chǎn)生許多新的突變，積累了單倍型的多樣性，但缺乏足夠時間積累核苷酸序列的多樣化[31]。本試驗中，錦江群體中遺傳多樣性較平舟河與樟江群體更為豐富，可能是因為錦江河段為中國少鱗鱖的生存和進化提供了較為優(yōu)越的自然條件。Cao等[5]在對中國少鱗鱖群體線粒體基因和核基因的研究中得到辰水河群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.8和0.0028，接近于本試驗中錦江群體，但高于平舟河和樟江群體；不僅如此，舞水、北江以及漠陽江群體的遺傳多樣性程度均與樟江群體一樣，但它們又低于錢塘江和澄家江群體的遺傳多樣性程度，呈現(xiàn)出長江流域遺傳多樣性水平高于珠江流域的趨勢。周文漪等[32-33]在對不同水系斑鱖(Sinipercascherzeri)的研究中得到，長江群體中的遺傳多樣性最高，這可能與長江流域范圍廣，分布區(qū)向西延伸至四川境內(nèi)，群體數(shù)量大，基因變異豐富，而珠江上游地理范圍相對狹小，與其他群體的基因交流缺乏有關(guān)。

3.3 遺傳分化及種群動態(tài)變化

遺傳分化指數(shù)是衡量群體間遺傳分化的重要指標(biāo)，遺傳分化指數(shù)接近于0時，表明群體間未發(fā)生遺傳分化，在0～1范圍內(nèi)，其值越大種群間的分化程度越高[34]。據(jù)Balloux等[35]的界定，遺傳分化指數(shù)為0～0.05表示極小遺傳分化；遺傳分化指數(shù)為0.05～0.15表示中度遺傳分化；遺傳分化指數(shù)為0.15～0.25表示較大遺傳分化；遺傳分化指數(shù)>0.25表示有極大的遺傳分化。在本試驗中，3個種群間的遺傳分化指數(shù)值均>0.25這個臨界值。此外，結(jié)合兩區(qū)段中基因流的值均<1，由此推斷，3個種群間均已存在極大的遺傳分化，基因交流頻率較為匱乏。這是由于地理隔絕致使生存環(huán)境不同，從而使3個群體產(chǎn)生如此的差異。這也就不難解釋3個群體間沒有共享單倍型的現(xiàn)象。通常情況下，F(xiàn)u′sFs中性檢驗和錯配堿基分布圖均能有效地檢測種群動態(tài)，該指標(biāo)對種群擴張現(xiàn)象較為敏感，當(dāng)出現(xiàn)顯著性的負(fù)值時，表明種群呈現(xiàn)出擴張現(xiàn)象；而錯配堿基分布圖在出現(xiàn)種群擴張現(xiàn)象的時候?qū)⒊尸F(xiàn)單峰模式[36]。Cytb和D-Loop區(qū)段的中性檢驗均未出現(xiàn)顯著負(fù)值，錯配堿基分布圖也未出現(xiàn)明顯單峰的趨勢，由此可推測，本試驗中中國少鱗鱖群體未出現(xiàn)過種群擴張史。

線粒體Cytb基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹有明顯的2個分支。在譜系1中發(fā)現(xiàn)，長江流域錦江群體和珠江流域中的群體聚類在一起，此結(jié)果與王偉偉等[37]對我國斑鱖不同群體的聚類結(jié)果一致。本試驗結(jié)果表明，既無受苗嶺山脈的阻擋而形成獨立的2個分支，也沒有與當(dāng)下水系對應(yīng)形成明顯的地理學(xué)關(guān)系。譜系1中單倍型最多，包含著2個流域中部分群體，有可能該譜系是中國少鱗鱖最古老的群體。推斷造成此類分支情況的原因：苗嶺山脈在第四紀(jì)因青藏高原大幅度整體抬升之前，不足以形成隔離的趨勢。隨著苗嶺地勢自東向西隆升和河流溯源侵蝕，苗嶺形成獨立單元[38]。自此，苗嶺兩側(cè)種群因地理阻隔和生境差異，沿不同的方向發(fā)展進化，并造就現(xiàn)今南北分化明顯和種群內(nèi)變異反差較大的遺傳結(jié)構(gòu)。

3.4 資源保護

遺傳多樣性高低通常能反映出該群體在環(huán)境中的適應(yīng)能力、生存能力以及進化能力。在本試驗中，雖然中國少鱗鱖遺傳多樣性相對豐富，但仍表現(xiàn)出高單倍型多樣性低核苷酸多樣性的現(xiàn)象。推測可能是中國少鱗鱖屬中小型鱖類，生活于河流上游及支流的溪澗中，其生長繁殖局限于局部水域中，擴散能力弱，群體較小，不同地理種群間的基因交流甚少，遺傳分化顯著，加之修建水壩和水環(huán)境惡化等原因，導(dǎo)致中國少鱗鱖補充群體逐年減少、資源量下降，進而有效群體的數(shù)量、規(guī)模迅速下降，出現(xiàn)瓶頸效應(yīng)，導(dǎo)致此類現(xiàn)象的發(fā)生[3-5]。

對此，建議漁業(yè)部門保護其遺傳資源，通過加強人們保護魚類資源的意識和優(yōu)化當(dāng)?shù)氐乃Y源，為魚類提供良好的生存環(huán)境。除此之外，修筑水壩電站改變了原有魚類的棲息環(huán)境，導(dǎo)致物種衰退，對此應(yīng)設(shè)計魚類洄游通道，旨在增加上下游魚類的基因交流頻率，豐富遺傳多樣性，提高瀕危物種的生存進化能力。

4 結(jié) 論

對貴州境內(nèi)苗嶺山脈兩側(cè)3個中國少鱗鱖自然群體的研究發(fā)現(xiàn)，群體間分化明顯，這與造山運動導(dǎo)致苗嶺山脈被繼續(xù)抬升有關(guān)；另外，3個群體中錦江群體遺傳資源相對豐富，同時提醒我們保護平舟河與樟江群體的資源狀況迫在眉睫。本試驗揭示了兩大流域中中國少鱗鱖亞群間的遺傳變異，為其種質(zhì)資源的保護和開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。