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        PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白GP5 的原核表達(dá)與鑒定

        2020-11-19 01:45:08于秀菊李鈺鈺韓小濤
        山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年11期
        關(guān)鍵詞:感受態(tài)耳病質(zhì)粒

        于秀菊,孫 錚,李鈺鈺,韓小濤

        (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山西太谷030801)

        豬繁殖和呼吸障礙綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱豬藍(lán)耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的疫病,主要特征表現(xiàn)為母豬嚴(yán)重繁殖障礙,仔豬嚴(yán)重呼吸障礙,生長緩慢,高死亡率[1-2]。世界衛(wèi)生組織將豬藍(lán)耳病列為法定報(bào)告B 類動(dòng)物疫病,在我國屬于二類動(dòng)物疫病[3]。其中,PRRSV 屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬[4],呈現(xiàn)二十面體結(jié)構(gòu),其主要結(jié)構(gòu)蛋白包括囊膜蛋白中的GP5、膜基質(zhì)蛋白(M)、核衣殼蛋白(N),其分別由病毒基因序列開放閱讀框ORF5、ORF6 和ORF7 編碼[5],在病毒的感染和增殖等過程中發(fā)揮重要的作用[6]。有研究證明,GP5 蛋白具有良好的免疫原性,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[7],其糖基化與體內(nèi)的病毒增殖密切相關(guān),并且GP5 在體內(nèi)外試驗(yàn)中均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,能與M 蛋白形成異源二聚體,并參與PRRSV 對(duì)靶細(xì)胞的感染過程[8],其常被作為構(gòu)建PRRSV 診斷試劑盒疫苗的重要靶標(biāo)之一[9]。

        本試驗(yàn)設(shè)計(jì)、優(yōu)化并合成了PRRSV 的GP5 成熟肽基因序列,通過PCR 擴(kuò)增、雙酶切和連接構(gòu)建原核表達(dá)載體pCold I-gp5,轉(zhuǎn)化并誘導(dǎo)GP5 重組蛋白的表達(dá),旨在為GP5 蛋白在豬繁殖和呼吸障礙綜合征預(yù)防和診斷中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 豬PRRSV 中GP5 蛋白基因的克隆

        根據(jù) Genbank 中豬 PRRSV 的 GP5 蛋白序列進(jìn)行比對(duì)和分析,選定gp5 基因的CDS 區(qū),去除其31 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽后,對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化,送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成,獲得優(yōu)化后的GP5 甘油菌。同時(shí),根據(jù)優(yōu)化序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的特異性引物,其上游引物序列為 F:5′-TAACGGGATCCAGCAATGATAGCAGCAG CC-3′,5' 端下劃線部分為添加的 HamH I 酶切位點(diǎn);R:5′-TTGATGTCGACTTACGGACGACCCCACT GTT-3′,5′端下劃線部分為添加的 Sal I 酶切位點(diǎn)。優(yōu)化后的GP5 甘油菌在LB-AMP 平板上劃線,挑取單克隆并轉(zhuǎn)接至LB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過夜,用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR 反應(yīng)體系為:模板質(zhì)粒1 μL,上下游引物各2 μL,Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)(Thermo scientific Fermentas,K1081)23 μL,ddH2O 22 μL,共 50 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃ 預(yù)變性 5 min;95 ℃變性 30 s,56 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 1 min,30 個(gè)循環(huán);72 ℃總延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 結(jié)果,并用凝膠回收試劑盒純化回收目的條帶。

        1.2 pCold I-gp5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

        對(duì)回收的gp5 基因和pCold I 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,50 μL 酶切體系(10×FD FastDigest buffer 5 μL,BamH I 2.5 μL,Sal I 2.5 μL,gp5 基因回收片段40 μL)。PCR 純化試劑盒純化后進(jìn)行連接,10 μL連接體系(T4 連接酶 1.5 μL,T4 連接 buffer 1.5 μL,酶切后的 pCold 2 μL,酶切回收的 gp5 基因 5 μL),22 ℃連接 30 min。10 μL 加入到 100 μL 的 DH5a 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化(冰上孵育20 min,42 ℃90 s,冰上3min);加入500μLLB培養(yǎng)基,37℃孵育30min;孵育后,取100 μL 涂布到含有氨芐青霉素(Amp)的LB 平板上,37 ℃過夜培養(yǎng);次日挑取2 個(gè)單克隆送測序公司進(jìn)行測序;將測序正確的菌液培養(yǎng)后提取pCold I-gp5 重組質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)化至BL21 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化(2 μL 加入到 100 μL 的 BL21中,冰上孵育 20 min,42 ℃ 90 s,冰上 3 min),將轉(zhuǎn)化后的BL21 感受態(tài)細(xì)胞涂板,平板培養(yǎng)后,挑取單克隆5 mL 振蕩培養(yǎng),并將含有pCold I-gp5 重組質(zhì)粒的菌株保存于-80 ℃冰箱中。

        1.3 BL21-GP5 誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

        將含有pCold I-gp5 重組質(zhì)粒的甘油菌轉(zhuǎn)接到含氨芐青霉素(Amp)的LB 培養(yǎng)基內(nèi),于37 ℃恒溫200 r/min 搖床培養(yǎng)12 h;將新鮮菌液轉(zhuǎn)接到500 mL含Amp 的LB 培養(yǎng)基中,待菌長至OD 值大約為0.5 時(shí),加入誘導(dǎo)劑 200 μL,15 ℃恒溫 150 r/min 誘導(dǎo)12 h;收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE 和Western Blotting 檢測。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 GP5 蛋白基因的獲取

        PCR 擴(kuò)增獲得的gp5 基因序列經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果顯示,與預(yù)期的大小一致,為532 bp(圖1),切下目的條帶,用PCR 凝膠試劑盒進(jìn)行回收純化。

        2.2 構(gòu)建GP5 重組質(zhì)粒

        GP5 的 PCR 回收產(chǎn)物和 pCold I 質(zhì)粒經(jīng)過BamH I 和Sal I 雙酶切后,分別通過PCR 純化試劑盒和凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化,純化后的目的基因片段和質(zhì)粒利用T4DNA 連接酶進(jìn)行連接反應(yīng);將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌,挑選陽性克隆,提取質(zhì)粒,并對(duì)重組質(zhì)粒pCold I-gp5 用BamH I 和Sal I 雙酶切進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明,構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確(圖2)。對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析,用Vector NTI 比對(duì)后,結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pCold I-gp5 的測序結(jié)果與gp5 優(yōu)化后的序列100%一致。

        2.3 SDS 電泳和 Western Blotting 結(jié)果

        將 pCold I-gp5 轉(zhuǎn)化至 Escherichia coli BL21 感受態(tài)細(xì)胞的陽性菌株,接種于含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)液中,于37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h,以1∶100 的稀釋比例,將新鮮菌液轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)液中,待培養(yǎng)物OD 值達(dá)到0.5 左右時(shí),加入IPTG,15 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h;分別收集未誘導(dǎo)組菌體蛋白、誘導(dǎo)組菌體蛋白、誘導(dǎo)菌體超聲破碎后的上清和沉淀,經(jīng)loading buffer 處理后進(jìn)行SDS-PAGE 檢測分析,結(jié)果顯示,大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白GP5 以可溶性蛋白的形式表達(dá)(圖3-A)。用鼠抗GP5 多克隆抗體檢測重組蛋白,結(jié)果顯示(圖3-B),表達(dá)的GP5 蛋白可與鼠抗GP5 抗體特異性結(jié)合,蛋白大小約為14 ku,與預(yù)計(jì)大小相符。說明構(gòu)建的重組質(zhì)粒在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確表達(dá)。

        3 結(jié)論與討論

        目前,豬藍(lán)耳病在世界范圍內(nèi)仍呈蔓延之勢,每次暴發(fā)都會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。不同日齡的豬均易感病,由于PRRSV 以肺泡巨噬細(xì)胞為靶細(xì)胞,從而破壞宿主的免疫功能,造成帶毒豬產(chǎn)生免疫抑制,易繼發(fā)感染其他疫病[11]。在生產(chǎn)中,常見藍(lán)耳病與豬瘟、偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、豬鏈球菌、豬流感病毒、豬霍亂沙門氏菌等混合或繼發(fā)感染,從而增加感染豬的死亡率[12]。

        預(yù)防PRRS 主要的疫苗是弱毒苗和滅活苗[13],但是免疫效果都不理想,其中,滅活苗接種主要誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,不能為宿主產(chǎn)生全面的免疫保護(hù);而弱毒苗有毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)[14]。很多研究者對(duì)PRRSV 的基因和蛋白進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn),PRRSV的基因組為15 kb,包含10 個(gè)開放閱讀框,其中,ORF5 編碼 PRRSV 的 GP5 蛋白(又稱 E 蛋白),該蛋白由200 個(gè)氨基酸組成[15]。大量研究表明,GP5 蛋白是PRRSV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白,是重要的免疫保護(hù)蛋白之一[16]。

        在原核表達(dá)過程中,目的基因、載體和宿主三者的關(guān)系是重組蛋白能否表達(dá)以及以何種形式表達(dá)和表達(dá)效率高低的影響因素[17-18]。本研究為了體外獲得較高表達(dá)量的可溶性GP5 重組蛋白,首先采用密碼子優(yōu)化方法人工合成目的片段,大大地提高了重組蛋白的表達(dá)量;同時(shí)為了提高GP5 的表達(dá)效率,選擇pCold-I 作為原核表達(dá)載體進(jìn)行15 ℃的低溫誘導(dǎo),獲得了可溶性重組蛋白GP5,該蛋白的獲取為進(jìn)一步研究GP5 的功能及其在預(yù)防豬藍(lán)耳病毒發(fā)生方面奠定了基礎(chǔ)。

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