于秀菊，孫 錚，李鈺鈺，韓小濤

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

豬繁殖和呼吸障礙綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的疫病，主要特征表現(xiàn)為母豬嚴(yán)重繁殖障礙，仔豬嚴(yán)重呼吸障礙，生長(zhǎng)緩慢，高死亡率[1-2]。世界衛(wèi)生組織將豬藍(lán)耳病列為法定報(bào)告B 類動(dòng)物疫病，在我國(guó)屬于二類動(dòng)物疫病[3]。其中，PRRSV 屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬[4]，呈現(xiàn)二十面體結(jié)構(gòu)，其主要結(jié)構(gòu)蛋白包括囊膜蛋白中的GP5、膜基質(zhì)蛋白（M）、核衣殼蛋白（N），其分別由病毒基因序列開放閱讀框ORF5、ORF6 和ORF7 編碼[5]，在病毒的感染和增殖等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[6]。有研究證明，GP5 蛋白具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[7]，其糖基化與體內(nèi)的病毒增殖密切相關(guān)，并且GP5 在體內(nèi)外試驗(yàn)中均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，能與M 蛋白形成異源二聚體，并參與PRRSV 對(duì)靶細(xì)胞的感染過(guò)程[8]，其常被作為構(gòu)建PRRSV 診斷試劑盒疫苗的重要靶標(biāo)之一[9]。

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)、優(yōu)化并合成了PRRSV 的GP5 成熟肽基因序列，通過(guò)PCR 擴(kuò)增、雙酶切和連接構(gòu)建原核表達(dá)載體pCold I-gp5，轉(zhuǎn)化并誘導(dǎo)GP5 重組蛋白的表達(dá)，旨在為GP5 蛋白在豬繁殖和呼吸障礙綜合征預(yù)防和診斷中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 豬PRRSV 中GP5 蛋白基因的克隆

根據(jù) Genbank 中豬 PRRSV 的 GP5 蛋白序列進(jìn)行比對(duì)和分析，選定gp5 基因的CDS 區(qū)，去除其31 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽后，對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成，獲得優(yōu)化后的GP5 甘油菌。同時(shí)，根據(jù)優(yōu)化序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的特異性引物，其上游引物序列為 F：5′-TAACGGGATCCAGCAATGATAGCAGCAG CC-3′，5' 端下劃線部分為添加的 HamH I 酶切位點(diǎn)；R：5′-TTGATGTCGACTTACGGACGACCCCACT GTT-3′，5′端下劃線部分為添加的 Sal I 酶切位點(diǎn)。優(yōu)化后的GP5 甘油菌在LB-AMP 平板上劃線，挑取單克隆并轉(zhuǎn)接至LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為：模板質(zhì)粒1 μL，上下游引物各2 μL，Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）（Thermo scientific Fermentas，K1081）23 μL，ddH2O 22 μL，共 50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 結(jié)果，并用凝膠回收試劑盒純化回收目的條帶。

1.2 pCold I-gp5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

對(duì)回收的gp5 基因和pCold I 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，50 μL 酶切體系（10×FD FastDigest buffer 5 μL，BamH I 2.5 μL，Sal I 2.5 μL，gp5 基因回收片段40 μL）。PCR 純化試劑盒純化后進(jìn)行連接，10 μL連接體系（T4 連接酶 1.5 μL，T4 連接 buffer 1.5 μL，酶切后的 pCold 2 μL，酶切回收的 gp5 基因 5 μL），22 ℃連接 30 min。10 μL 加入到 100 μL 的 DH5a 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化（冰上孵育20 min，42 ℃90 s，冰上3min）；加入500μLLB培養(yǎng)基，37℃孵育30min；孵育后，取100 μL 涂布到含有氨芐青霉素（Amp）的LB 平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；次日挑取2 個(gè)單克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序；將測(cè)序正確的菌液培養(yǎng)后提取pCold I-gp5 重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至BL21 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化（2 μL 加入到 100 μL 的 BL21中，冰上孵育 20 min，42 ℃ 90 s，冰上 3 min），將轉(zhuǎn)化后的BL21 感受態(tài)細(xì)胞涂板，平板培養(yǎng)后，挑取單克隆5 mL 振蕩培養(yǎng)，并將含有pCold I-gp5 重組質(zhì)粒的菌株保存于-80 ℃冰箱中。

1.3 BL21-GP5 誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

將含有pCold I-gp5 重組質(zhì)粒的甘油菌轉(zhuǎn)接到含氨芐青霉素（Amp）的LB 培養(yǎng)基內(nèi)，于37 ℃恒溫200 r/min 搖床培養(yǎng)12 h；將新鮮菌液轉(zhuǎn)接到500 mL含Amp 的LB 培養(yǎng)基中，待菌長(zhǎng)至OD 值大約為0.5 時(shí)，加入誘導(dǎo)劑 200 μL，15 ℃恒溫 150 r/min 誘導(dǎo)12 h；收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE 和Western Blotting 檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GP5 蛋白基因的獲取

PCR 擴(kuò)增獲得的gp5 基因序列經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，與預(yù)期的大小一致，為532 bp（圖1），切下目的條帶，用PCR 凝膠試劑盒進(jìn)行回收純化。

2.2 構(gòu)建GP5 重組質(zhì)粒

GP5 的 PCR 回收產(chǎn)物和 pCold I 質(zhì)粒經(jīng)過(guò)BamH I 和Sal I 雙酶切后，分別通過(guò)PCR 純化試劑盒和凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，純化后的目的基因片段和質(zhì)粒利用T4DNA 連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，并對(duì)重組質(zhì)粒pCold I-gp5 用BamH I 和Sal I 雙酶切進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確（圖2）。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，用Vector NTI 比對(duì)后，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pCold I-gp5 的測(cè)序結(jié)果與gp5 優(yōu)化后的序列100%一致。

2.3 SDS 電泳和 Western Blotting 結(jié)果

將 pCold I-gp5 轉(zhuǎn)化至 Escherichia coli BL21 感受態(tài)細(xì)胞的陽(yáng)性菌株，接種于含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)液中，于37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h，以1∶100 的稀釋比例，將新鮮菌液轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)液中，待培養(yǎng)物OD 值達(dá)到0.5 左右時(shí)，加入IPTG，15 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h；分別收集未誘導(dǎo)組菌體蛋白、誘導(dǎo)組菌體蛋白、誘導(dǎo)菌體超聲破碎后的上清和沉淀，經(jīng)loading buffer 處理后進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白GP5 以可溶性蛋白的形式表達(dá)（圖3-A）。用鼠抗GP5 多克隆抗體檢測(cè)重組蛋白，結(jié)果顯示（圖3-B），表達(dá)的GP5 蛋白可與鼠抗GP5 抗體特異性結(jié)合，蛋白大小約為14 ku，與預(yù)計(jì)大小相符。說(shuō)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

目前，豬藍(lán)耳病在世界范圍內(nèi)仍呈蔓延之勢(shì)，每次暴發(fā)都會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。不同日齡的豬均易感病，由于PRRSV 以肺泡巨噬細(xì)胞為靶細(xì)胞，從而破壞宿主的免疫功能，造成帶毒豬產(chǎn)生免疫抑制，易繼發(fā)感染其他疫病[11]。在生產(chǎn)中，常見藍(lán)耳病與豬瘟、偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、豬鏈球菌、豬流感病毒、豬霍亂沙門氏菌等混合或繼發(fā)感染，從而增加感染豬的死亡率[12]。

預(yù)防PRRS 主要的疫苗是弱毒苗和滅活苗[13]，但是免疫效果都不理想，其中，滅活苗接種主要誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，不能為宿主產(chǎn)生全面的免疫保護(hù)；而弱毒苗有毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)[14]。很多研究者對(duì)PRRSV 的基因和蛋白進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV的基因組為15 kb，包含10 個(gè)開放閱讀框，其中，ORF5 編碼 PRRSV 的 GP5 蛋白（又稱 E 蛋白），該蛋白由200 個(gè)氨基酸組成[15]。大量研究表明，GP5 蛋白是PRRSV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白，是重要的免疫保護(hù)蛋白之一[16]。

在原核表達(dá)過(guò)程中，目的基因、載體和宿主三者的關(guān)系是重組蛋白能否表達(dá)以及以何種形式表達(dá)和表達(dá)效率高低的影響因素[17-18]。本研究為了體外獲得較高表達(dá)量的可溶性GP5 重組蛋白，首先采用密碼子優(yōu)化方法人工合成目的片段，大大地提高了重組蛋白的表達(dá)量；同時(shí)為了提高GP5 的表達(dá)效率，選擇pCold-I 作為原核表達(dá)載體進(jìn)行15 ℃的低溫誘導(dǎo)，獲得了可溶性重組蛋白GP5，該蛋白的獲取為進(jìn)一步研究GP5 的功能及其在預(yù)防豬藍(lán)耳病毒發(fā)生方面奠定了基礎(chǔ)。