于秀菊，孫 錚，李鈺鈺，韓小濤

（山西農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西太谷030801）

豬繁殖和呼吸障礙綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的疫病，主要特征表現(xiàn)為母豬嚴重繁殖障礙，仔豬嚴重呼吸障礙，生長緩慢，高死亡率[1-2]。世界衛(wèi)生組織將豬藍耳病列為法定報告B 類動物疫病，在我國屬于二類動物疫病[3]。其中，PRRSV 屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬[4]，呈現(xiàn)二十面體結構，其主要結構蛋白包括囊膜蛋白中的GP5、膜基質蛋白（M）、核衣殼蛋白（N），其分別由病毒基因序列開放閱讀框ORF5、ORF6 和ORF7 編碼[5]，在病毒的感染和增殖等過程中發(fā)揮重要的作用[6]。有研究證明，GP5 蛋白具有良好的免疫原性，能夠誘導機體產生中和抗體[7]，其糖基化與體內的病毒增殖密切相關，并且GP5 在體內外試驗中均能誘導細胞凋亡，能與M 蛋白形成異源二聚體，并參與PRRSV 對靶細胞的感染過程[8]，其常被作為構建PRRSV 診斷試劑盒疫苗的重要靶標之一[9]。

本試驗設計、優(yōu)化并合成了PRRSV 的GP5 成熟肽基因序列，通過PCR 擴增、雙酶切和連接構建原核表達載體pCold I-gp5，轉化并誘導GP5 重組蛋白的表達，旨在為GP5 蛋白在豬繁殖和呼吸障礙綜合征預防和診斷中的應用提供基礎。

1 材料和方法

1.1 豬PRRSV 中GP5 蛋白基因的克隆

根據(jù) Genbank 中豬 PRRSV 的 GP5 蛋白序列進行比對和分析，選定gp5 基因的CDS 區(qū)，去除其31 個氨基酸的信號肽后，對其進行密碼子優(yōu)化，送至上海生工生物工程有限公司進行合成，獲得優(yōu)化后的GP5 甘油菌。同時，根據(jù)優(yōu)化序列設計帶有酶切位點和保護堿基的特異性引物，其上游引物序列為 F：5′-TAACGGGATCCAGCAATGATAGCAGCAG CC-3′，5' 端下劃線部分為添加的 HamH I 酶切位點；R：5′-TTGATGTCGACTTACGGACGACCCCACT GTT-3′，5′端下劃線部分為添加的 Sal I 酶切位點。優(yōu)化后的GP5 甘油菌在LB-AMP 平板上劃線，挑取單克隆并轉接至LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過夜，用質粒小提試劑盒提取質粒。以提取的質粒為模板進行PCR 擴增，PCR 反應體系為：模板質粒1 μL，上下游引物各2 μL，Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）（Thermo scientific Fermentas，K1081）23 μL，ddH2O 22 μL，共 50 μL。反應條件為：95 ℃ 預變性 5 min；95 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 結果，并用凝膠回收試劑盒純化回收目的條帶。

1.2 pCold I-gp5 重組質粒的構建

對回收的gp5 基因和pCold I 質粒進行雙酶切，50 μL 酶切體系（10×FD FastDigest buffer 5 μL，BamH I 2.5 μL，Sal I 2.5 μL，gp5 基因回收片段40 μL）。PCR 純化試劑盒純化后進行連接，10 μL連接體系（T4 連接酶 1.5 μL，T4 連接 buffer 1.5 μL，酶切后的 pCold 2 μL，酶切回收的 gp5 基因 5 μL），22 ℃連接 30 min。10 μL 加入到 100 μL 的 DH5a 感受態(tài)細胞中進行轉化（冰上孵育20 min，42 ℃90 s，冰上3min）；加入500μLLB培養(yǎng)基，37℃孵育30min；孵育后，取100 μL 涂布到含有氨芐青霉素（Amp）的LB 平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)；次日挑取2 個單克隆送測序公司進行測序；將測序正確的菌液培養(yǎng)后提取pCold I-gp5 重組質粒，將其轉化至BL21 感受態(tài)細胞中進行轉化（2 μL 加入到 100 μL 的 BL21中，冰上孵育 20 min，42 ℃ 90 s，冰上 3 min），將轉化后的BL21 感受態(tài)細胞涂板，平板培養(yǎng)后，挑取單克隆5 mL 振蕩培養(yǎng)，并將含有pCold I-gp5 重組質粒的菌株保存于-80 ℃冰箱中。

1.3 BL21-GP5 誘導表達與鑒定

將含有pCold I-gp5 重組質粒的甘油菌轉接到含氨芐青霉素（Amp）的LB 培養(yǎng)基內，于37 ℃恒溫200 r/min 搖床培養(yǎng)12 h；將新鮮菌液轉接到500 mL含Amp 的LB 培養(yǎng)基中，待菌長至OD 值大約為0.5 時，加入誘導劑 200 μL，15 ℃恒溫 150 r/min 誘導12 h；收集菌體進行SDS-PAGE 和Western Blotting 檢測。

2 結果與分析

2.1 GP5 蛋白基因的獲取

PCR 擴增獲得的gp5 基因序列經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示，與預期的大小一致，為532 bp（圖1），切下目的條帶，用PCR 凝膠試劑盒進行回收純化。

2.2 構建GP5 重組質粒

GP5 的 PCR 回收產物和 pCold I 質粒經過BamH I 和Sal I 雙酶切后，分別通過PCR 純化試劑盒和凝膠回收試劑盒進行回收純化，純化后的目的基因片段和質粒利用T4DNA 連接酶進行連接反應；將連接產物轉化至感受態(tài)大腸桿菌，挑選陽性克隆，提取質粒，并對重組質粒pCold I-gp5 用BamH I 和Sal I 雙酶切進行鑒定，結果表明，構建的重組質粒正確（圖2）。對測序結果進行分析，用Vector NTI 比對后，結果顯示，重組質粒pCold I-gp5 的測序結果與gp5 優(yōu)化后的序列100%一致。

2.3 SDS 電泳和 Western Blotting 結果

將 pCold I-gp5 轉化至 Escherichia coli BL21 感受態(tài)細胞的陽性菌株，接種于含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)液中，于37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h，以1∶100 的稀釋比例，將新鮮菌液轉接到新的培養(yǎng)液中，待培養(yǎng)物OD 值達到0.5 左右時，加入IPTG，15 ℃誘導表達12 h；分別收集未誘導組菌體蛋白、誘導組菌體蛋白、誘導菌體超聲破碎后的上清和沉淀，經loading buffer 處理后進行SDS-PAGE 檢測分析，結果顯示，大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的重組蛋白GP5 以可溶性蛋白的形式表達（圖3-A）。用鼠抗GP5 多克隆抗體檢測重組蛋白，結果顯示（圖3-B），表達的GP5 蛋白可與鼠抗GP5 抗體特異性結合，蛋白大小約為14 ku，與預計大小相符。說明構建的重組質粒在大腸桿菌表達系統(tǒng)能夠準確表達。

3 結論與討論

目前，豬藍耳病在世界范圍內仍呈蔓延之勢，每次暴發(fā)都會給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經濟損失[10]。不同日齡的豬均易感病，由于PRRSV 以肺泡巨噬細胞為靶細胞，從而破壞宿主的免疫功能，造成帶毒豬產生免疫抑制，易繼發(fā)感染其他疫病[11]。在生產中，常見藍耳病與豬瘟、偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、豬鏈球菌、豬流感病毒、豬霍亂沙門氏菌等混合或繼發(fā)感染，從而增加感染豬的死亡率[12]。

預防PRRS 主要的疫苗是弱毒苗和滅活苗[13]，但是免疫效果都不理想，其中，滅活苗接種主要誘導體液免疫應答，不能為宿主產生全面的免疫保護；而弱毒苗有毒力返強的風險[14]。很多研究者對PRRSV 的基因和蛋白進行深入研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV的基因組為15 kb，包含10 個開放閱讀框，其中，ORF5 編碼 PRRSV 的 GP5 蛋白（又稱 E 蛋白），該蛋白由200 個氨基酸組成[15]。大量研究表明，GP5 蛋白是PRRSV 的主要結構蛋白之一，是誘導產生中和抗體的主要蛋白，是重要的免疫保護蛋白之一[16]。

在原核表達過程中，目的基因、載體和宿主三者的關系是重組蛋白能否表達以及以何種形式表達和表達效率高低的影響因素[17-18]。本研究為了體外獲得較高表達量的可溶性GP5 重組蛋白，首先采用密碼子優(yōu)化方法人工合成目的片段，大大地提高了重組蛋白的表達量；同時為了提高GP5 的表達效率，選擇pCold-I 作為原核表達載體進行15 ℃的低溫誘導，獲得了可溶性重組蛋白GP5，該蛋白的獲取為進一步研究GP5 的功能及其在預防豬藍耳病毒發(fā)生方面奠定了基礎。