馬東麗，石玉星，張寶俊，任 璐

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西太谷030801）

從植物中發(fā)掘具有抑制病原物生長(zhǎng)或增強(qiáng)植物抗病能力的植物內(nèi)生菌是新農(nóng)藥研究和創(chuàng)制的方向之一。其中，植物中的內(nèi)生細(xì)菌已在多種植物的不同組織中被分離篩選出來(lái)，并且是迄今為止發(fā)現(xiàn)的相對(duì)豐富的生防資源，其制劑不僅降低了化學(xué)農(nóng)藥用量，還緩解了化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)的負(fù)面問題，對(duì)綠色和低毒化農(nóng)藥的發(fā)展具有重要意義。已有研究顯示，一些內(nèi)生細(xì)菌在植物病害的生物防治上具有良好的效果[1-3]。ARIMA 等[4]研究報(bào)道，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可抗菌、抗病毒；PAPAVIZAS[5]和 HWAGNG 等[6]報(bào)道了利用（Bacillus subtilis）可防治多種土傳真菌病害。

隨著對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌認(rèn)識(shí)的不斷加深，其分離源也不斷擴(kuò)大。目前，已報(bào)道的植物分離源主要有藥用雜草、糧食作物、藥用樹木、蔬菜等陸生植物。另外，近年來(lái)隨著生物保鮮領(lǐng)域的發(fā)展，其分離源也擴(kuò)大到采后海生植物、果蔬及種子[7-9]。從不同植物中分離到的內(nèi)生菌能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，其可以抑制或殺死植物病原菌，從而增強(qiáng)植物的抗病性[10-12]，或者植物內(nèi)生細(xì)菌還可通過競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等方式來(lái)誘導(dǎo)植物抗病性的產(chǎn)生[13]。水稻、玉米等多種植物內(nèi)生菌已被廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治[14-15]。

曼陀羅（Datura stramonium）是茄科曼陀羅屬野生、直立、木質(zhì)的1 年生大型草本植物，普遍生長(zhǎng)于溫帶、熱帶地區(qū)，并且在全國(guó)各地廣泛分布[16]。曼陀羅中所含的生物堿對(duì)多種疾病的治療研究在病理方面已取得重大成果[17]。周靜等[18]研究發(fā)現(xiàn)，曼陀羅提取物對(duì)菜青蟲和黏蟲均具有觸殺和拒食作用。但目前尚未見曼陀羅內(nèi)生菌對(duì)植物病原真菌具有拮抗作用的相關(guān)報(bào)道。

本研究從曼陀羅中篩選出1 株對(duì)多種植物病原真菌具有良好抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其殺菌譜、分類地位及防治效果進(jìn)行研究，以期為利用拮抗內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行植物病害的生物防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物材料均是摘取健康無(wú)傷的組織，裝入無(wú)菌樣品袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室即刻進(jìn)行內(nèi)生菌分離。植物組織包括檉樹莖，番茄根、莖、葉，花椒果實(shí)，葡萄莖、葉，辣椒根、莖、葉，曼陀羅葉、花，醉魚草根、莖、葉。

供試植物病原真菌為菜豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum），菜豆炭疽病菌（Colletotrichum lindemuthianum），番茄灰霉病菌（Bortytis cinerea），番茄早疫病菌（Alternaria solani），谷瘟病菌（Pyricularia grisea），黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea），胡蘿卜褐腐病菌（Leptosphaeria libanotis），核桃腐爛病菌（Monilinia laxa），辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporium），棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani），蘋果腐爛病菌（Valsa mali），桃褐腐病菌（Monilinia fructicola），西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum），小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum），均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物內(nèi)生細(xì)菌的分離 采用裴淑蘭等[19]的方法進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離。分別對(duì)不同植物的根、莖、葉和果實(shí)進(jìn)行無(wú)菌水超聲波清洗，晾干后切成適合的小塊；依次浸泡于75%乙醇2 min、3%次氯酸鈉30 s、75%乙醇30 s，每次浸泡后均用無(wú)菌水沖洗3 次；后放入無(wú)菌研缽中，加入10 mL 無(wú)菌水，研碎后取汁液稀釋后涂布于NA 平板培養(yǎng)基上，每濃度3 次重復(fù)，30 ℃下培養(yǎng)3～7 d；待平板內(nèi)長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)菌落顏色、大小、突起特征等挑取形態(tài)差異較明顯的菌落，用平板劃線法轉(zhuǎn)接于空白NA 平板，對(duì)新長(zhǎng)出的菌落再劃線分離2～3 次，獲得純培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接于NA 斜面，于4 ℃保存。

1.2.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選

1.2.2.1 初篩 經(jīng)預(yù)試驗(yàn)選取Pyricularia grisea 為靶標(biāo)菌，采用謝宗華等[20]的四點(diǎn)平板對(duì)峙法篩選出拮抗菌株。用直徑5 mm 的打孔器在已培養(yǎng)5 d 的Pyricularia grisea 病菌菌落邊緣取菌餅，并接種在PDA 平板中央，然后接種已分離純化的供試內(nèi)生細(xì)菌于四周20 mm 處；對(duì)照組僅接種Pyricularia grisea，每處理重復(fù)3 次。在28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)7 d 后，觀察是否有抑菌帶產(chǎn)生，并測(cè)定抑菌帶大小，計(jì)算抑制率。

1.2.2.2 復(fù)篩 以Pyricularia grisea 為靶標(biāo)菌，通過生長(zhǎng)速率法進(jìn)行復(fù)篩。將分離純化后的內(nèi)生細(xì)菌接種到LB 培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min 下振蕩培養(yǎng)72h；終止發(fā)酵后，在 4℃、12000r/min 下離心 10min，棄去菌體，收集上清發(fā)酵液，并通過0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到發(fā)酵濾液；將發(fā)酵濾液和PDA 培養(yǎng)基按1∶9（V∶V）比例均勻混合，以制備平板；待平板培養(yǎng)基固化后接入Pyricularia grisea 菌餅，并在26.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，以空白PDA 僅接種Pyricularia grisea 為對(duì)照，每處理進(jìn)行3 次重復(fù)，培養(yǎng)7 d 后，通過十字交叉法測(cè)定菌落直徑，計(jì)算抑制率。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 內(nèi)生拮抗細(xì)菌MY1 抑菌譜測(cè)定

1.3.1.1 菌株MY1 抑菌活性測(cè)定 采用1.2.2.1 的平板對(duì)峙法，測(cè)定菌株MY1 對(duì)多種供試病原真菌的抑制率。

1.3.1.2 菌株MY1 代謝物抑菌活性的測(cè)定 采用1.2.2.2 的生長(zhǎng)速率法，測(cè)定菌株MY1 的發(fā)酵液對(duì)多種供試病原真菌的抑制率。對(duì)制得的發(fā)酵液分別進(jìn)行2 種處理：一種是通過0.22 μm 微孔濾膜過濾；另一種是在高溫滅菌鍋121 ℃滅菌30 min；以2 種方式處理的發(fā)酵液和PDA 培養(yǎng)基按1∶9（V∶V）的比例混合均勻以制備平板。采用生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定對(duì)14 種病原菌的抑制活性；培養(yǎng)3～7 d 后測(cè)定各個(gè)菌落直徑，計(jì)算抑制率。

1.3.2 菌株MY1 鑒定 將菌株MY1 點(diǎn)接于NA 培養(yǎng)基上，26.5 ℃活化培養(yǎng)24 h 后，用肉眼直接觀察菌落的顏色、光澤、質(zhì)地、邊緣情況、表面情況、透明度等形態(tài)特征；用掃描電鏡觀察內(nèi)生細(xì)菌MY1 的菌體、芽孢形態(tài)及大小。

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[21]對(duì)菌株MY1的生理生化特征進(jìn)行鑒定。將菌株MY1 的16SrDNA序列（測(cè)序由寶生物工程（大連）有限公司完成）與GenBank 中序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，選擇與之有高度同源性的菌株基因序列，使用MEGA 5.05 軟件分析并構(gòu)建菌株MY1 的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 菌株MY1 防效測(cè)定

1.3.3.1 預(yù)防效果測(cè)定 選取5、6 葉期長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄幼苗，在葉片分別噴灑MY1 發(fā)酵液原液、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、100 倍稀釋液以及對(duì)照藥劑腐霉利（50%WP）和清水對(duì)照。待自然晾干后，接種灰霉病菌和早疫病菌菌餅（直徑5 mm），置于24 ℃、95%相對(duì)濕度下培養(yǎng)3 d，后采用十字交叉法測(cè)定每片葉片的病斑直徑，計(jì)算防治效果。每處理10 株，每株調(diào)查5 片葉片。

1.3.3.2 治療效果測(cè)定 在葉片上接種灰霉病菌和早疫病菌菌餅，24 h 后噴灑1.3.3.1 各處理液；后置于24 ℃、95%相對(duì)濕度條件下培養(yǎng)3 d，測(cè)定每片葉片的病斑直徑，計(jì)算防治效果。每處理10 株，每株調(diào)查5 片葉片。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物內(nèi)生細(xì)菌的分離及篩選

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、濕潤(rùn)度等特征，分別從不同植物組織中分離得到87 株拮抗細(xì)菌，其中，根部23 株、莖部 25 株、葉部 30 株、果實(shí)部 9 株，葉部分離到的拮抗細(xì)菌最多，占34.5%。

隨機(jī)選擇17 株內(nèi)生細(xì)菌菌株進(jìn)行初步篩選，17 株拮抗細(xì)菌均對(duì)Pyricularia grisea 具有一定的抑制作用，且抑制率在45.36%～69.17%，其中，菌株MY1 對(duì)Pyricularia grisea 的抑制率最高。

測(cè)定了17 株內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的抑菌活性，抑制率在16.93%～91.33%，其中，菌株ZJ1 和MY1發(fā)酵液對(duì)Pyricularia grisea 的抑菌率較高，分別達(dá)到91.33%和90.6%?？梢赃x擇菌株ZJ1、MY1 進(jìn)行后續(xù)研究，本研究選擇曼陀羅內(nèi)生細(xì)菌MY1 進(jìn)行鑒定及抑菌譜的測(cè)定。

2.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌MY1 抑菌譜測(cè)定結(jié)果

2.2.1 菌株MY1 抑菌活性測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株MY1 對(duì)供試病原真菌具有一定的抑制作用，抑制率在50.06%～100%（表1），其中，對(duì)桃褐腐病菌和谷瘟病菌的抑制率較高，分別達(dá)到98.95%和92.65%；對(duì)于菜豆炭疽病菌的抑菌效果較差，抑制率為50.06%；對(duì)其他病原真菌的抑制率在59.56%～76.86%。抑菌效果如圖1 所示。

表1 菌株MY1 對(duì)14 種病原真菌的抑制作用

2.2.2 菌株MY1 發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定結(jié)果 對(duì)發(fā)酵液過微孔濾膜后，MY1 發(fā)酵液對(duì)14 種病原真菌的抑制率在76.65%～100%（表2），其中，抑制率在95%以上的有桃褐腐病菌、谷瘟病菌、黃瓜灰霉病菌、蘋果腐爛病菌、核桃腐爛病菌5 種病原真菌；抑制率在90%～95%的有4 種、80%～90%的有3 種、在75%～80%的有2 種。經(jīng)高溫處理后，對(duì)14 種病原真菌的抑制率僅有2.54%～49.85%，其中，僅對(duì)黃瓜灰霉病菌和谷瘟病菌的的抑制率在45%以上；抑制率低于20%的有9 種、介于25%～45%的有3 種，抑菌作用較過微孔濾膜處理明顯減弱。抑菌效果如圖2 所示。

表2 菌株MY1 發(fā)酵液對(duì)14 種病原真菌的抑制率分析 %

2.3 內(nèi)生細(xì)菌MY1 的鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)特征觀察 曼陀羅內(nèi)生菌MY1 培養(yǎng)性狀：菌落為米白色，邊緣裂葉狀，表面干燥且不透明（圖3），表明菌株MY1 與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）較為相似；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MY1 菌株菌體呈桿狀，周生鞭毛，大小為（0.5～1.5）μm×（1.5～2.0）μm（圖 4）。

2.3.2 生理生化鑒定 對(duì)菌株MY1 各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，生理生化檢測(cè)結(jié)果表明，菌株MY1可以利用檸檬酸鹽與接觸酶反應(yīng)，并可以發(fā)酵葡萄糖，甲基紅試驗(yàn)呈陰性，V-P 測(cè)定呈陽(yáng)性，并且可水解淀粉和纖維素，硝酸鹽還原呈陽(yáng)性，亞硝酸還原呈陰性，吲哚試驗(yàn)呈陰性，可使明膠部分液化，可產(chǎn)生硫化氫，并且可氧化乙醇和乙酸。該菌株可耐受4、20、30、37、41、45、65 ℃的環(huán)境，可以在含有 2%～10%的NaCl 培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，對(duì)甘露醇、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖5 種碳源均有較好的利用率。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征，菌株MY1 初步被鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 菌株MY1 16S rDNA 全序列解析，獲得序列長(zhǎng)度為1 427 bp，測(cè)序后的序列上傳至GenBank（登錄號(hào)為MN055702）；將16S rDNA 序列與GenBank 中登錄相似的16S rDNA 序列進(jìn)行比對(duì)，選取具有較高同源性的菌株基因序列，使用MEGA 5.05 軟件進(jìn)行分析，并采用Neighbor-Joining 法構(gòu)建MY1 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示（圖 5），MY1 菌株與 Bacillus methylotrophicus 聚于同一分支，同源性達(dá)到100%，具有較高的親緣關(guān)系。綜合形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果，初步將菌株MY1 確定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌。

2.4 內(nèi)生拮抗細(xì)菌MY1 防治效果測(cè)定

菌株MY1 發(fā)酵液原液及各稀釋倍數(shù)發(fā)酵液均對(duì)番茄灰霉病和番茄早疫病具有一定的預(yù)防和治療效果（表3），其中，發(fā)酵液原液及5～50 倍發(fā)酵液稀釋液對(duì)灰霉病和早疫病的防治效果均超過60%，其中，5 倍稀釋發(fā)酵液的預(yù)防和治療效果最好，對(duì)灰霉病分別達(dá)到86.4%和80.2%，對(duì)早疫病分別達(dá)到88.9%和82.6%，且與50%腐霉利WP 對(duì)照藥劑的預(yù)防和治療效果間沒有顯著差異；發(fā)酵液原液的防治效果低于5 倍稀釋發(fā)酵液和對(duì)照藥劑，且預(yù)防效果高于治療效果。

表3 發(fā)酵液對(duì)盆栽番茄灰霉病和早疫病的防治效果 %

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生細(xì)菌是一種生防資源，其分布廣、種類多、存在于絕大多數(shù)植物中，在生物防治中具有重要意義[22]。許多野生植物由于生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)、抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)環(huán)境復(fù)雜等特性，成為篩選內(nèi)生細(xì)菌的有利植物資源[23]。本研究從檉樹、番茄、花椒、葡萄、曼陀羅和醉魚草等植物的不同組織中共分離得到87 株內(nèi)生細(xì)菌，根、莖、葉和果實(shí)中均可以分離得到，通過生長(zhǎng)速率法篩選發(fā)現(xiàn)，對(duì)谷瘟病菌抑制作用高于80%的內(nèi)生細(xì)菌有7 株，其中5 株來(lái)源于野生草本植物，且從草本植物莖和葉中分離的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量高于根部，這與林木組織中內(nèi)生細(xì)菌分布以根部最多存在差異[24]，其原因還有待進(jìn)一步研究。

本研究測(cè)定曼陀羅內(nèi)生細(xì)菌MY1 的抑菌譜發(fā)現(xiàn)，該菌株抑菌譜較廣，特別對(duì)桃褐腐病菌和桃褐腐病菌抑制率高達(dá)90%以上，且發(fā)酵液抑菌活性高于活菌菌體。該菌株的抑菌活性同已報(bào)道的多株植物內(nèi)生細(xì)菌相比具有更高的抑菌活性[25-27]，說(shuō)明菌株MY1 在植物病害防治中具有良好的應(yīng)用潛力。今后還需進(jìn)一步進(jìn)行室內(nèi)盆栽試驗(yàn)及田間防效研究。

《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[21]從形態(tài)學(xué)及生理生化的角度為細(xì)菌鑒定提供了參考，并對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌的種類進(jìn)行了大致的分類，但是，由于同屬內(nèi)生細(xì)菌或近緣內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征和生理生化特征較為接近，因此，僅憑這些特征很難對(duì)種別進(jìn)行判定。近年來(lái)，16S rDNA 序列分析已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定和系統(tǒng)分類研究，以有效區(qū)分無(wú)法依靠形態(tài)及生理生化特性區(qū)分的菌株，這是一種常用且較為準(zhǔn)確的細(xì)菌鑒定方法。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定以及16S rDNA 序列分析方法，將菌株MY1 鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。但是這3 種手段的聯(lián)合使用對(duì)于一些近緣種依然較難準(zhǔn)確鑒定，由于序列間的相似度太高，16S rDNA 基因序列分析往往容易失效[23，28]，如區(qū)分枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。因此，可以進(jìn)一步加入一些特異基因（如芽孢桿菌中的gyrA 和gyrB），從而更加準(zhǔn)確地確定其分類地位[29]。

本研究表明，菌株MY1 發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病和早疫病具有較好的防治效果，推測(cè)該菌株主要是通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)發(fā)揮作用。室內(nèi)盆栽防效同已報(bào)道的多株生防內(nèi)生細(xì)菌相比較相似[30-33]。但由于菌株本身、番茄品種、試驗(yàn)條件以及處理方式和處理時(shí)間的不同，防效略有差異，且不同來(lái)源菌株和不同種菌株，在植物病害的防治上存在一定差異，還需進(jìn)一步加強(qiáng)其定殖特性和田間防效的研究。

本研究對(duì)菌株MY1 的抑菌特性和分類地位進(jìn)行了探討，除此之外，關(guān)于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌生物防治的研究報(bào)道還包括生防機(jī)制研究、可濕性粉劑制備和乳懸劑制備等[34-36]，今后將繼續(xù)進(jìn)行菌株MY1 抑菌物質(zhì)的鑒定及抑菌機(jī)制的探索，并進(jìn)行生防菌劑的制備，以期明確其生防機(jī)制和田間應(yīng)用價(jià)值，為微生物農(nóng)藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。