胡亮，李瑞蓮，王銀紅*

1.湖南省藥品檢驗(yàn)研究院，湖南藥用輔料檢驗(yàn)檢測(cè)中心，長(zhǎng)沙 410001；2.湖南省藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙410001

金雞顆粒處方由金櫻根、雞血藤、兩面針、功勞木、穿心蓮和千斤拔6味藥材組成，具有清熱解毒、健脾除濕、通絡(luò)活血等作用，通常用于濕熱下注引起的附件炎、盆腔炎等癥［1-4］，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》［5］。兩面針為蕓香科植物兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）D C.的干燥根。具有活血化瘀，行氣止痛，祛風(fēng)通絡(luò)等功效［6-8］。金雞顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)兩面針進(jìn)行質(zhì)量控制，同時(shí)《中國(guó)藥典》2015 年版一部收載的兩面針?biāo)幉捻?xiàng)下明確規(guī)定應(yīng)不得檢出毛兩面針?biāo)兀?］，但現(xiàn)實(shí)狀況是兩面針?biāo)幉牡馁Y源不足，兩面針常見(jiàn)混有偽品飛龍掌血（特征成分為毛兩面針?biāo)兀┑?，?shí)際生產(chǎn)中可能存在替代兩面針投料生產(chǎn)的情況［9-10］。

本文采用薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）建立了金雞顆粒中毛兩面素的檢查方法［11］，并對(duì)收集的21 批樣品進(jìn)行檢查研究，具體方法如下。

1 儀器與試藥

Waters Xevo G2 Q-TOF 液質(zhì)聯(lián)用儀；Waters 2695 液相色譜儀；2998 二級(jí)管陣列檢測(cè)器（沃特世科技有限公司）；METTLER AE240 型電子天平（梅特勒-托利多，萬(wàn)分之一）；XSE205DU 型電子天平（梅特勒-托利多，十萬(wàn)分之一）；超聲波清洗儀KQ500DE（500W，40KHz）；進(jìn)口硅膠G 預(yù)制板TLC Silica gel 60（Merck）。毛兩面針?biāo)貙?duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111531-201603）；乙腈為色譜純（Fisher Chemical），其他試劑均為分析純。樣品來(lái)源為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)工作金雞系列品種抽驗(yàn)樣品及企業(yè)提供的部分樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 兩面針薄層色譜鑒別

取本品8 g，研細(xì)，加水30 mL 使溶解，用濃氨試液調(diào)pH 值至11，用二氯甲烷振搖提取2 次，每次30 mL，合并二氯甲烷提取液，蒸干，殘?jiān)? mL 二氯甲烷使溶解，作為供試品溶液。另取兩面針對(duì)照藥材1 g，加水30 mL，煮沸30 min，放冷，自“用濃氨試液調(diào)pH 值至11”起，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方工藝制成不含兩面針的樣品，同供試品溶液制備方法制成缺兩面針陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015 年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-濃氨試液（40∶1∶0.2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，在紫外光365 nm 下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，斑點(diǎn)清晰，分離度較好,見(jiàn)圖1。

圖1 兩面針薄層色譜鑒別圖

2.2 兩面針摻偽研究

2.2.1 薄層色譜（TLC）檢查取本品8 g，研細(xì)，加乙醇40 mL，密塞，超聲處理40 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?mL 使溶解，作為供試品溶液。取毛兩面針?biāo)貙?duì)照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015 年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取對(duì)照溶液5 μL，供試品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（20 ∶5 ∶3 ∶1 ∶0.18）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，出現(xiàn)與毛兩面針?biāo)叵嗤伾陌唿c(diǎn)，提示可能存在用兩面針混偽品投料的情況,見(jiàn)圖2。

圖2 毛兩面針?biāo)乇由V鑒別圖

2.2.2 高效液相色譜（HPLC）檢查對(duì)照品溶液的制備：取毛兩面針?biāo)貙?duì)照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 mL 中含30 μg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：取本品適量，研細(xì)，取4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率500 W,頻率40 KHz）40 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。陰性對(duì)照溶液的制備：另按顆粒劑處方稱取除兩面針外的其他藥味及輔料適量，按照樣品制備工藝，同法制備陰性對(duì)照溶液。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：采用Hypersil BDS C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35℃；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（21 ∶79）；PDA 檢測(cè)器，流速：0.8 min/mL；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm。理論塔板數(shù)按毛兩面針?biāo)胤逵?jì)算應(yīng)不低于3 000。取金雞顆粒陰性樣品溶液、毛兩面針?biāo)貙?duì)照品溶液和初篩顯陽(yáng)性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖,見(jiàn)圖3。

圖3 高效液相色譜圖

采用二極管陣列檢測(cè)器比較相應(yīng)色譜峰在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍的紫外吸收光譜，初篩顯示金雞顆粒陽(yáng)性樣品溶液與毛兩面針?biāo)貙?duì)照品溶液的PDA 檢測(cè)紫外吸收光譜圖基本一致，見(jiàn)圖4。

圖4 紫外－可見(jiàn)吸收光譜圖

2.2.3 液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS/MS）確證3批疑似陽(yáng)性樣品采用HPLC-MS/MS 進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果均出現(xiàn)與毛兩面針?biāo)貙?duì)照色譜保留時(shí)間相同的色譜峰，且相應(yīng)的提取離子流色譜圖與對(duì)照品一致。具體條件為：ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（1.8 μm，50 mm×2.1 mm）；以乙腈-10 mmol醋酸銨溶液（18∶82）為流動(dòng)相；柱溫30 ℃；電噴霧電離源（ESI），正離子模式，毛細(xì)管電壓2.5 kv，錐孔電壓40 V，萃取錐孔電壓4.0 V，脫溶劑溫度350 ℃，鞘氣流速600 L/h。毛兩面針?biāo)貙?duì)照品溶液ESI+分子離子峰為m/z 309.13，與其結(jié)構(gòu)吻合。對(duì)照品溶液及陽(yáng)性樣品溶液一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜掃描圖見(jiàn)圖5。

圖5 液質(zhì)聯(lián)用分析圖

2.2.4 篩查結(jié)果在本次篩查的21 批次樣品中，共有3 批金雞顆粒樣品檢出毛兩面針?biāo)?，?yáng)性樣品色譜保留時(shí)間與對(duì)照品色譜保留時(shí)間一致，且樣品峰在210～400 nm 波長(zhǎng)范圍的紫外吸收光譜與對(duì)照品基本一致。對(duì)3 批次陽(yáng)性樣品采用HPLC-MS/MS進(jìn)行確認(rèn)，出現(xiàn)與毛兩面針?biāo)貙?duì)照品色譜保留時(shí)間相同的色譜峰，且與對(duì)照品的二級(jí)質(zhì)譜圖一致。涉及樣品含量范圍為65.48～73.94 μg/g。

2.3 HPLC含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取毛兩面針?biāo)貙?duì)照品12.22 mg，置50 mL 量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液①（244.4 μg/mL），精密量取對(duì)照品溶液①3 mL 置10 mL 量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液②（73.32 μg/mL）。

2.3.2 供試品溶液的制備及色譜條件供試品溶液的制備及色譜條件均同“2.2.2”項(xiàng)。

2.3.3 線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品溶液②1、5、8、10 μL，對(duì)照品溶液①5、10 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為：Y=3×106X-2.03×105，R2=0.999 5。結(jié)果表明：毛兩面針?biāo)貙?duì)照品在0.073 32～2.444 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液②（73.32 μg/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，分別記錄峰面積，計(jì)算RSD 為0.74%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)取金雞顆粒（批號(hào)20160101），分別按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各6 份，進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行分析，金雞顆粒中毛兩面針?biāo)睾科骄禐?1.53 μg/g，RSD 為1.69%。結(jié)果表明該法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.3.6”項(xiàng)下金雞顆粒同一份供試品溶液，室溫下放置，在0、2、6、12、22 h分別進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行分析，分別記錄峰面積，計(jì)算RSD 為0.48%，結(jié)果表明供試品溶液在22 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn)取已測(cè)定含量的樣品（20160101，含毛兩面針?biāo)?1.53 μg/g）2.0 g，共6 份，分別精密稱定，置已精密加入對(duì)照品溶液②（73.32 μg/mL）1.80 mL 蒸干后的具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。在上述液相色譜條件下進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法計(jì)算加樣回收率，6 批樣品平均回收率為94.3%，RSD 為0.61%。結(jié)果表明該法加樣回收率較好。

2.3.8 檢出限和定量限精密量取“2.3.1”項(xiàng)下毛兩面針?biāo)貙?duì)照溶液①（244.4 μg/mL）1 mL 置200 mL 容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，得對(duì)照品溶液③（1.222 μg/mL），根據(jù)進(jìn)樣量不同，以信噪比為3∶1 的濃度作為儀器檢出限，信噪比為10 ∶1 的濃度為儀器定量限，測(cè)定其檢出限和定量限分別為1.22 ng 和3.44 ng。

2.3.9 樣品測(cè)定取金雞顆粒陽(yáng)性樣品，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算含量，測(cè)定結(jié)果表明3 批次毛兩面針?biāo)仄骄繛?0.31 μg/g，其中最高為73.94 μg/g，最低為65.48 μg/g。

3 討論

由于兩面針?biāo)幉纳L(zhǎng)周期較長(zhǎng)，需求量逐年增加而野生資源不斷減少，導(dǎo)致兩面針市場(chǎng)混偽現(xiàn)象嚴(yán)重，造成臨床療效和用藥安全隱患。本文建立了金雞顆粒中兩面針的薄層色譜鑒別方法，同時(shí)對(duì)21批次樣品進(jìn)行毛兩面針?biāo)貦z查。結(jié)果表明，21 批次樣品中3 批次檢出毛兩面針?biāo)?，檢出率為14%，表明可能存在用兩面針混偽品投料生產(chǎn)的情況，應(yīng)對(duì)中成藥制劑中的摻偽或偽品投料情況引起高度重視，并加強(qiáng)監(jiān)管力度。