穆文靜，栗 慧，孫豐梅，魏 東

(1.河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000；2.河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 張家口 075000；3.張家口市特色農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000)

恩諾沙星(enrofloxacin,ENLX)是第一個(gè)畜禽專用的氟喹諾酮類藥物[1]，因其抗菌廣譜、高效低毒、價(jià)格低廉等特點(diǎn)而被廣泛使用。隨著ENLX的大量使用，其殘留問題所帶來(lái)的危害也不容忽視。首先，人類長(zhǎng)期攝入含有獸藥殘留的動(dòng)物源性食品后，會(huì)在體內(nèi)造成藥物蓄積，當(dāng)累積到一定濃度以后，就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生相應(yīng)的毒副作用[2]，嚴(yán)重時(shí)對(duì)人體造成傷害；其次，畜禽動(dòng)物反復(fù)攝入某一種抗菌藥物后，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的耐藥菌株[3]，這些耐藥菌株可通過動(dòng)物源性食品進(jìn)入人體，以至于不能找到相應(yīng)的對(duì)抗藥物進(jìn)行及時(shí)治療，從而給臨床治療帶來(lái)一定的挑戰(zhàn)。因此，加強(qiáng)獸藥在動(dòng)物源性食品中的殘留檢測(cè)和監(jiān)督具有十分重要的意義。由于ENLX藥物殘留會(huì)給人類的健康帶來(lái)嚴(yán)重的危害，世界上許多國(guó)家都制定了ENLX的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其中世界衛(wèi)生組織推薦恩諾沙星的最高殘留限量為40 μg·kg-1[4]，歐盟等許多國(guó)家制定了ENLX在牛、豬、家禽的肝、腎、肌肉中的最高殘留限量為30 μg·kg-1[5]，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB31650—2019[6]制定了ENLX的ADI值為0～6.2 μg·kg。

目前，ENLX藥物殘留的檢測(cè)方法主要有：微生物法、高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳分析法、化學(xué)發(fā)光法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和免疫分析法等[7]。上述方法各有利弊，其中微生物法適合初步的大量篩選，但其檢測(cè)靈敏度不高，對(duì)氟喹諾酮類藥物的檢出限一般都高于國(guó)家允許的最高殘留檢測(cè)限量，且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果短時(shí)間內(nèi)不容易取得[8]；高效液相色譜法具有較高的靈敏度，但處理復(fù)雜，需要昂貴的儀器設(shè)備，對(duì)操作儀器的工作人員也有較高的要求，因此該方法并不適合廣泛推廣應(yīng)用；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，具有較高的靈敏度，可以同時(shí)鑒別多種成分，從而可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多種殘留組分[9]，但該方法與高效液相色譜法都需要具備昂貴的儀器設(shè)備，因此并不適合大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；高效毛細(xì)管電泳法(high performance capillary electrophoresis,HPCE)是近年發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、樣品用量少、分析速度快等特點(diǎn)，有利于實(shí)際樣品的分析，但該方法的缺點(diǎn)是其檢測(cè)限不能控制在較低的水平下；免疫分析法中的酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)具備操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、不需要昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，具有專一性，因此廣泛用于農(nóng)藥、獸藥、激素類的殘留檢測(cè)[10]。

本研究通過免疫BALB/c小鼠并結(jié)合間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法篩選出高特異性的多克隆抗體，該抗體的成功制備為以后開發(fā)一種快速、高效的動(dòng)物源性食品藥物殘留檢測(cè)新技術(shù)提供了幫助。

1 材 料

1.1 主要試劑

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)、恩諾沙星、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購(gòu)自Sigma公司,25%戊二醛購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,二甲基甲酰胺(dimethylformamide,DMF)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司,HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、TMB顯色液來(lái)自北京索萊寶公司,Tween-20購(gòu)自阿拉丁化學(xué)品有限公司,羊血清來(lái)自河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)室,BALB/c小鼠來(lái)自河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要儀器

高速離心機(jī)(TGL-16A)購(gòu)自金壇市儀都儀器有限公司，紫外-可見分光光度計(jì)購(gòu)自鉑金埃爾默儀器有限公司，電子天平(JJ323BC)北京賽多利斯儀器有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司；JB-2型恒溫磁力攪拌器購(gòu)自上海雷磁新經(jīng)儀器有限公司，孵育器購(gòu)自杭州米歐儀器有限公司。

2 方 法

2.1 免疫抗原(ENLX-BSA)

采用戊二醛法制備免疫原，以BSA為載體蛋白，首先稱取0.01 g恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶解于3 mL DMF中，室溫反應(yīng)4 h。稱取0.03 g BSA充分溶于3 mL PBS中，將ENLX溶液緩慢加入到含有BSA的PBS溶液中，隨后再逐滴加入30 μL的25%戊二醛，室溫條件下反應(yīng)4 h。然后將混合液加入到煮沸處理過的透析袋中，用PBS液透析3 d，每天換3次透析液，于4°冰箱中透析，3 d后8 000 rpm離心，離心20 min，取上清液，分裝置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 檢測(cè)抗原(ENLX-OVA)的制備

具體步驟同2.1，用OVA替代BSA。

2.3 完全抗原的紫外掃描光譜鑒定

以PBS緩沖液做為空白對(duì)照組，用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)ENLX、BSA、OVA、ENLX-OVA、ENLX-BSA 5種試劑進(jìn)行紫外掃描鑒定，通過觀察其最大吸收峰值來(lái)鑒定偶聯(lián)結(jié)果。

2.4 動(dòng)物免疫

選取4～6周大的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，采取腹腔注射和皮下注射2種免疫方法，每?jī)芍苊庖?次，共免疫4次，200 μg/只。第一次用免疫原和弗氏完全佐劑的混合液進(jìn)行小鼠腹部免疫；第二、三次免疫用弗氏不完全佐劑和免疫原的混合液進(jìn)行免疫，第三次免疫后7 d斷尾取血測(cè)效價(jià);第四次用免疫原免疫，對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶采血。取血離心，取上清液，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 用間接ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)

2.5.1 間接ELISA操作步驟

1)包被抗原

首先用檢測(cè)抗原包被酶標(biāo)板，每孔加100 μL，4 ℃包被過夜；PBST洗滌3次，每次3 min(簡(jiǎn)寫為3×3，后同)，拍干。

2)加封閉液

取5%羊血清每孔200 μL，37 ℃孵育器中孵育2 h；用PBST(3×3)洗滌，拍干。

3)加一抗

加抗血清每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌3次，每次3分鐘，在吸水紙上拍干。

4)加酶標(biāo)二抗

加酶標(biāo)二抗，用PBS緩沖液稀釋至合適倍數(shù)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；PBST(3×3)洗滌，拍干。

5)顯色

將顯色液A、B液充分混勻后加入到酶標(biāo)板中，避光顯色10～20 min。

6)終止

用硫酸終止整個(gè)反應(yīng)，每孔50 μL硫酸，用酶標(biāo)儀讀取各孔A490值[11]。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

無(wú)ENLX抑制的A490值為B0，各濃度ENLX抑制的A490值為B；縱坐標(biāo)以各濃度的A490值轉(zhuǎn)換成%B/B0(抑制率I倒數(shù))，以ENLX對(duì)數(shù)Lg[ENLX]為橫坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

圖1 完全抗原ENLX-BSA紫外圖譜掃描

3 結(jié)果與分析

3.1 完全抗原的紫外光譜掃描鑒定

由圖1可知，ENLX的最大峰值在271 nm處，ENLX-BSA在265 nm處，BSA的最大峰值在278 nm處，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)ENLX、ENLX-BSA、BSA三者的最大峰值都不相同，且偶聯(lián)物的最大吸收波長(zhǎng)向紅外區(qū)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，證明免疫抗原偶聯(lián)成功。

圖2 檢測(cè)抗原ENLX-OVA紫外掃描圖譜

由圖2可以看出，ENLX的最大峰值在271 nm處，ENLX-OVA的最大峰值在266 nm處，OVA的最大峰值在280 nm處，觀察得出ENLX、ENLX-OVA、OVA這三者的最大峰值有明顯差異，且ENLX-OVA的最大吸收波長(zhǎng)向紅外區(qū)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，證明檢測(cè)抗原偶聯(lián)成功。

3.2 完全抗原免疫學(xué)鑒定結(jié)果

第4次免疫后7 d，各組取任意一只小鼠眼眶采血，采用間接ELISA法測(cè)定血清中抗體效價(jià)，并用酶標(biāo)儀測(cè)每孔在490 nm的A值，選用1.0左右的A值為檢測(cè)抗原的理想工作濃度，其中ENLX-OVA理想包被濃度為0.5μg·ml-1，血清稀釋位數(shù)為32 000倍。結(jié)果良好，為下一步實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。

表1 ELISA檢測(cè)小鼠抗ENLX血清效價(jià) μg·mL-1

3.3 ENLX ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖3 ENLX ci-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

恩諾沙星的ic-ELISA檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。以%B/B0(抑制率I倒數(shù))為縱坐標(biāo)，以ENLX濃度對(duì)數(shù)Lg[ENLX]為橫坐標(biāo)，擬和的線性回歸直線方程為y=-19.229x+91.957(R2=0.9922)，符合線性關(guān)系的判斷標(biāo)準(zhǔn)，從圖中可見ENLX的最低檢測(cè)限為1.19 ng·ml-1。

4 討 論

恩諾沙星(ENLX)不具有免疫性，必須與載體蛋白(BSA、OVA)偶聯(lián)才可進(jìn)行小鼠免疫。本實(shí)驗(yàn)采用戊二醛法將ENLX與BSA、OVA偶聯(lián)在一起，對(duì)ENLX、ENLX-BSA、ENLX-OVA等偶聯(lián)物進(jìn)行紫外掃描，觀察其峰值發(fā)生了明顯移動(dòng)，說明藥物偶聯(lián)成功。用免疫原免疫小鼠測(cè)定效價(jià)結(jié)果為1：32 000，該結(jié)果說明藥物成功偶聯(lián)。傳統(tǒng)的免疫方法分為腹腔注射[12-13]和皮下注射[14]兩種方法，免疫間隔期為2周[15],免疫的次數(shù)為4次[16]。本研究采用皮下注射和腹腔注射兩種方法結(jié)合在一起對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫試驗(yàn)，免疫間隔期為3周，共免疫6次，最后測(cè)得的結(jié)果顯示抗血清IC50和檢測(cè)限都比趙銀麗[16]所測(cè)得的檢測(cè)限低很多。

抗血清效價(jià)測(cè)定最簡(jiǎn)單的判定方法是肉眼觀察，以陰性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔比較，發(fā)現(xiàn)含有特異性抗體的孔呈現(xiàn)橙黃色并且抗體量越多孔的顏色越深。二是通過儀器設(shè)備酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定其吸光度值來(lái)判定其效價(jià)，其中陰性對(duì)照血清測(cè)定的A值為N，待測(cè)抗血清測(cè)定的A值為P，若1.5

0.2判為陽(yáng)性，P/N≤1.5為陰性[17]。ENLX的整個(gè)制備過程要求實(shí)驗(yàn)所有用到的玻璃器皿必須全部浸泡在酸缸中24 h，之后用大量清水沖洗干凈，烘干備用，盡量避免實(shí)驗(yàn)器皿不潔影響到藥物偶聯(lián)的最佳效果。

另外，中國(guó)對(duì)FQNS類藥物殘留的檢測(cè)技術(shù)還需進(jìn)一步發(fā)展，快速高效的檢測(cè)技術(shù)才更有利于保障食品安全，保障人民的身體健康。同時(shí)，也能促進(jìn)國(guó)內(nèi)畜牧業(yè)的快速發(fā)展，使中國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)能夠迅速與國(guó)際接軌[18]。監(jiān)督管理部門應(yīng)積極宣傳相關(guān)的科普知識(shí)，使人們了解食用含有獸藥殘留的動(dòng)物源性食品對(duì)身體的嚴(yán)重危害。科研人員應(yīng)快速研制出操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏的新技術(shù)。