丁紅軍，張艷龍，孟慧鵬，王克強(qiáng)，孫倩，李燕菊，何峰

0 引言

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一，約占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%～40%，具有復(fù)發(fā)率高、治愈率低等特點(diǎn)[1-2]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，SOX2[3]、ASCL1[4]、Notch1[5]等神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可能在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，逐漸引起了人們的廣泛關(guān)注。有研究顯示髓鞘轉(zhuǎn)錄因子MyT1在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常，但其生物學(xué)功能研究尚少[6-7]。本課題通過(guò)shRNA慢病毒技術(shù)在人腦膠質(zhì)瘤U-118MG和U-87MG細(xì)胞中靶向沉默MyT1基因，觀察它對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲和黏附能力的影響及相關(guān)分子機(jī)制，為深入研究MyT1基因的生物學(xué)功能及人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞HEK293T、人腦膠質(zhì)瘤U-118MG和U-87MG細(xì)胞株為天津大學(xué)精儀學(xué)院神經(jīng)工程與康復(fù)實(shí)驗(yàn)室保存，均使用DMEM+10%FBS在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。FuGene轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑、RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒和SYBR? green PCR試劑盒等購(gòu)自美國(guó)LifeTechnology公司，Transwell小室購(gòu)自中國(guó)Corning公司，兔抗人MyT1與鼠抗人β-actin等抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。引物合成和DNA測(cè)序由中國(guó)金唯智公司完成。熒光定量PCR儀型號(hào)為ABI 7900HT Fast real-time PCR System。

1.2 方法

1.2.1 pLVX-iMyT1質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 利用在線(xiàn)Ambion shRNA軟件設(shè)計(jì)一組靶向MyT1基因的shRNA序列，合成對(duì)應(yīng)的正義和反義DNA模板，引物序列見(jiàn)表1。37℃退火1 h，連接到經(jīng)BglⅡ和HindⅢ酶切的慢病毒表達(dá)載體pLVX上，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞獲得重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pLVX-iMyT1。陽(yáng)性克隆送交華大基因公司進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 MyT1-shRNA慢病毒的產(chǎn)生與細(xì)胞的感染 分別在3種慢病毒包裝質(zhì)粒VSVG（3 μg）、pMDL（5 μg）和REV（2.5 μg）中加入shMyT1、shRNA空載體質(zhì)粒12 μg制備成復(fù)合物，加入FuGene試劑轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染48 h后的病毒上清液。將病毒液過(guò)濾后分別感染到U-118MG和U-87MG細(xì)胞以產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系，熒光顯微鏡下觀察不同細(xì)胞系中GFP標(biāo)簽的表達(dá)情況以表征感染效率。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 qPCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中mRNA與蛋白的表達(dá) 在100 mm培養(yǎng)皿中將shMyT1組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)至密度達(dá)到80%，分別使用TRIzol法提取其總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照qPCR試劑說(shuō)明配制20 μl 體系PCR反應(yīng)混合液進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)各基因mRNA的表達(dá)。qPCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性30 s、55℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保存。

同樣在上述細(xì)胞中加入600 μl Lysis Buffer冰上裂解后提取細(xì)胞總蛋白，將總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗β-actin（1:10 000）、MyT1（1:5 000），二抗羊抗兔和羊抗鼠（1:10 000）孵育，依次進(jìn)行底物發(fā)光和曝光等操作。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，采用BandScan 5.0軟件分析結(jié)果。

1.2.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力 將U-118MG和U-87MG細(xì)胞制成5×108/L細(xì)胞懸液鋪于60 mm培養(yǎng)皿中長(zhǎng)至80%～90%密度，分別設(shè)shMyT1組和對(duì)照組，用滅菌槍頭在孔板中央筆直劃痕，PBS洗去脫落細(xì)胞后加入不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基置于孵育箱培養(yǎng)，分別在0、60 h拍照，計(jì)算遷移率。劃痕遷移率=（原始劃痕寬度-遷移后劃痕寬度）/原始劃痕寬度×100%。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力 將U-118MG和U-87MG細(xì)胞制成5×108/L細(xì)胞懸液，分別設(shè)shMyT1組和對(duì)照組，將200 μl細(xì)胞懸液滴加至預(yù)先鋪好Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室中，6孔板下室預(yù)先加入500 μl DMEM+10%FBS培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，用棉簽擦去Transwell小室內(nèi)Matrigel膠后，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色，再經(jīng)PBS洗滌3次，在顯微鏡下觀察上室下表面上、中、下、左、右的5個(gè)視野，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的黏附能力 將U-118MG和U-87MG細(xì)胞制成5×108/L細(xì)胞懸液，分別設(shè)shMyT1組和對(duì)照組，將細(xì)胞懸液滴加至Fibrenection隔夜包被的60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，吸去上清培養(yǎng)基及未貼壁細(xì)胞后，輕輕用PBS洗3次，使用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色，再經(jīng)PBS洗滌3次，在顯微鏡下拍照，并通過(guò)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)黏附細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果均符合正態(tài)分布，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用兩因素兩水平方差分析進(jìn)行析因分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MyT1的表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)了MyT1在不同細(xì)胞系中的表達(dá)情況，與人正常腦膠質(zhì)細(xì)胞HEB相比，MyT1在腦膠質(zhì)瘤U-118MG和U-87MG細(xì)胞中顯著高表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)人正常腦膠質(zhì)細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MyT1的表達(dá)水平Figure 1 MyT1 expression level in normal human brain glia and glioma cells detected by Western blot

2.2 shRNA慢病毒靶向沉默腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MyT1的效果

我們?cè)趯?gòu)建成功的pLVX-iMyT1質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中包裝成shRNA慢病毒，感染了U-118MG和U-87MG細(xì)胞，通過(guò)qPCR和Western blot從mRNA和蛋白水平分別檢測(cè)細(xì)胞中MyT1基因的沉默效果。

qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，靶向沉默MyT1后U-118MG和U-87MG細(xì)胞中MyT1 mRNA水平分別下降了約85%和90%，見(jiàn)圖2A。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，U-118MG和U-87MG細(xì)胞中MyT1蛋白水平也顯著降低，見(jiàn)圖2B。這些結(jié)果說(shuō)明，不論在mRNA水平還是蛋白水平，U-118MG和U-87MG細(xì)胞中MyT1的表達(dá)都發(fā)生了顯著下調(diào)。

圖2 qPCR(A)和Western blot(B)法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中靶向沉默MyT1基因的效果Figure 2 Targeted silencing of MyT1 gene in glioma cells detected by qPCR(A) and Western blot(B)

2.3 靶向沉默MyT1對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向沉默MyT1后，U-118MG和U-87MG細(xì)胞的遷移距離顯著短于對(duì)照組（P=0.010），60 h時(shí)只有對(duì)照組的41.5%和42.0%（P=0.012），見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，敲低MyT1基因后腦膠質(zhì)瘤U-118MG和U-87MG細(xì)胞的遷移能力顯著下降。

2.4 靶向沉默MyT1對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向沉默MyT1后，U-118MG和U-87MG細(xì)胞侵襲穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組（P=0.015），分別只有對(duì)照組的58.0%和60.5%（P=0.022），見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，敲低MyT1基因后腦膠質(zhì)瘤U-118MG和U-87MG細(xì)胞的侵襲能力顯著下降。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶向沉默MyT1對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響Figure 3 Effect of targeted silencing of MyT1 on migration of glioma cells detected by wound-healing assay

2.5 靶向沉默MyT1對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞黏附能力的影響

細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向沉默MyT1后，U-118MG和U-87MG細(xì)胞黏附在Fibronection包被培養(yǎng)皿上的細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組（P=0.021），分別只有對(duì)照組的18.0%和18.3%（P=0.026），見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，敲低MyT1基因后腦膠質(zhì)瘤U-118MG和U-87MG細(xì)胞的黏附能力顯著下降。

2.6 靶向沉默MyT1對(duì)細(xì)胞黏附和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，靶向沉默MyT1后，U-118MG和U-87MG細(xì)胞中E-cadherin、CLDN1、CLDN2、ITGA5等相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著下降，而MMP9、CXCR4、c-FOS等腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著上升，見(jiàn)圖6。結(jié)果說(shuō)明，靶向沉默MyT1基因后腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的改變可能與這些基因改變有關(guān)。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶向沉默MyT1對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 4 Effect of targeted silencing of MyT1 on invasion of glioma cells detected by Transwell assay

圖5 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶向沉默MyT1對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞黏附能力的影響Figure 5 Effect of targeted silencing of MyT1 on adhesion of glioma cells detected by cell adhesion assay

圖6 靶向沉默MyT1對(duì)細(xì)胞黏附和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Figure 6 Effects of targeted silencing of MyT1 on expression of cell adhesion- and tumor metastasis-related genes

3 討論

正常生理狀態(tài)下，髓鞘轉(zhuǎn)錄因子MyT1主要表達(dá)于發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中[8-9]，介導(dǎo)少突膠細(xì)胞的增殖分化和神經(jīng)細(xì)胞髓鞘的形成[10-12]。Myt1蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有特殊的CCHHC（即Cys-X4-Cys-X4-His-X7-His-X5-Cys）結(jié)構(gòu)，能夠識(shí)別以“AAGTT”為核心的靶序列，特異性結(jié)合在多種神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的啟動(dòng)子上[13]，募集HDAC蛋白Sin3B[14]或者和LSD1組成復(fù)合物[15]，通過(guò)改變相關(guān)基因的組蛋白修飾特征等方式調(diào)控其表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的神經(jīng)元性分化和增殖[16]。這些結(jié)果說(shuō)明MyT1是神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的重要調(diào)控基因。1997年Hessler研究小組[6]首次報(bào)道了MyT1基因在人高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中存在顯著的表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象，隨后Sebolt-Leopold小組[17]報(bào)道敲低MyT1基因能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞周期抑制并誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生，最近Wotton小組[7]報(bào)道MyT1能夠通過(guò)影響YAP1基因的表達(dá)影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，由此可見(jiàn)，MyT1基因在腦膠質(zhì)瘤中可能發(fā)揮著重要的作用，影響著腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展和患者的預(yù)后。

為深入研究MyT1基因在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能及其對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，我們構(gòu)建了特異性靶向MyT1基因的shRNA質(zhì)粒，在HEK293中包裝得到shRNA慢病毒，分別感染腦膠質(zhì)瘤U-118MG和U-87MG細(xì)胞，得到穩(wěn)定感染的細(xì)胞株。通過(guò)qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該shRNA慢病毒在mRNA和蛋白水平均很好的實(shí)現(xiàn)了對(duì)MyT1基因的沉默效應(yīng)，通過(guò)BrdU實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤U-118MG和U-87MG細(xì)胞中敲低MyT1基因后細(xì)胞的遷移、侵襲、黏附能力明顯低于對(duì)照組。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，敲低MyT1后細(xì)胞中的E-cadherin、CLDN1、CLDN2、ITGA5等細(xì)胞黏附相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著下降，而MMP9、CXCR4、c-FOS等腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著上升。這些結(jié)果說(shuō)明，敲低MyT1基因可以從多個(gè)方面顯著抑制腦膠質(zhì)瘤U-118MG和U-87MG細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，從而影響腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。未來(lái)，本課題組將以此為基礎(chǔ)，深入研究MyT1的生物學(xué)功能及表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，期望明確MyT1是否可成為腦膠質(zhì)瘤診療的分子標(biāo)志。