李海利，馮麗麗，王英華，徐引弟，張青嫻，王治方，朱文豪，許 峰，游 一，王克領(lǐng)

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所,河南 鄭州 450002; 3.河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450008)

豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)引起的豬呼吸系統(tǒng)的一種嚴(yán)重的接觸性傳染性疾病[1-2]。急性者病死率高，慢性者常能耐過(guò)。豬感染APP后很容易繼發(fā)其他細(xì)菌性或病毒性疾病，導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢，飼料利用率低，降低飼料報(bào)酬[3]。自1957年首次報(bào)道豬胸膜肺炎以來(lái)，各個(gè)國(guó)家陸續(xù)發(fā)生和流行[4]。目前，該病已在世界各地廣泛流行，一直呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著各個(gè)國(guó)家養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[5-6]。

發(fā)生該病時(shí)常應(yīng)用抗生素進(jìn)行治療，雖能挽回?fù)p失和降低死亡率，但是經(jīng)過(guò)抗生素治療的豬成為帶菌豬，給其他健康豬造成了嚴(yán)重威脅，成為其他豬的傳染源[7]；另外抗生素的頻繁應(yīng)用經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥菌株，使抗生素治療成為一個(gè)長(zhǎng)期難以解決的問(wèn)題，給細(xì)菌病的防治帶來(lái)了挑戰(zhàn)[8]。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)APP對(duì)氨基糖苷類(lèi)耐藥基因的研究報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)APP氨基糖苷類(lèi)耐藥現(xiàn)狀和耐藥流行分子特征也不清楚。鑒于此，調(diào)查河南省及周邊地區(qū)APP對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥情況，對(duì)從臨床病例中分離鑒定出的85株APP進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)及耐藥基因的擴(kuò)增，旨在為臨床用藥和新藥研制提供參考，為控制APP耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播提供有力的手段。

1 材料和方法

1.1 菌株

臨床分離鑒定的85株APP菌株，-80 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

牛心浸汁PPLO(含5%馬血清和100 μg/mL NAD)、Taq酶等購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 APP生化試驗(yàn)及血清定型鑒定

1.3.1 菌株 將分離鑒定的85株APP接種于牛心浸汁PPLO(含5%馬血清和100 μg/mL NAD)置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.2 APP生化試驗(yàn)鑒定 取純培養(yǎng)的單菌落接種于各種細(xì)菌生化培養(yǎng)管，觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.3.3 細(xì)菌血清型定型鑒定 取純化培養(yǎng)的細(xì)菌，制備適宜濃度的細(xì)菌菌懸液，與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清不同血清型APP(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，進(jìn)行凝集試驗(yàn)，觀察凝集現(xiàn)象，確定分離菌的血清型。

1.4 藥敏試驗(yàn)

采用紙片法進(jìn)行氨基糖苷類(lèi)藥物藥敏試驗(yàn)，根據(jù)抑菌圈大小判定耐藥、中等耐藥或者敏感。

1.5 基因組提取及耐藥基因檢測(cè)

1.5.1 細(xì)菌基因組DNA的提取 將每株細(xì)菌在牛心浸汁PPLO(含5%馬血清和100 μg/mL NAD)瓊脂平板上培養(yǎng)，5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24～72 h。收集細(xì)菌，提取DNA。

海倫·凱勒已悄悄起床，她摸到書(shū)桌前，打開(kāi)昨天還未讀完的盲文書(shū)，仔細(xì)摸著，摸著。天氣尤寒，海倫的手不禁在微微打顫。時(shí)間總是過(guò)得飛快，天完全亮了，海倫迎來(lái)了一天中第一縷陽(yáng)光，海倫笑了，笑得那樣燦爛，像陽(yáng)光一樣。知識(shí)的滿足和陽(yáng)光的溫暖，給海倫帶來(lái)了慰藉。

1.5.2 耐藥基因的PCR檢測(cè)

1.5.2.1 引物合成與設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性較好的引物，ant2-Ⅰa-F：5′-TGTACAGTCTATGCCTCG-3′，ant2-Ⅰa-R：5′-CAAGACCTCAACCTTTTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段635 bp；aac3-Ⅱc-F：5′-TCGGTTGGATGACAAAGC-3′，aac3-Ⅱc-R：5′-TCTCAAGATAGGTGACGC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段572 bp；aac3-Ⅳ-F：5′-TCGTGCAATACGAATGGC-3′，aac3-Ⅳ-R：5′-CAACGTCATCTCGTTCTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段809 bp。上述引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5.2.2 耐藥基因的檢測(cè) PCR反應(yīng)體系：體系為50 μL，dNTP(0.15 mmol/L)1 μL，Taq酶(0.04 U/μL)0.5 μL，引物(10 μmol/L)1 μL，Mg2+(2.0 mmol/L)0.5 μL，Mix 25 μL，ddH2O 22 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2.5 min；95 ℃變性55 s，55 ℃退火37 s，72 ℃延伸3.5 min，31個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸4.5 min。

1.5.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及測(cè)序 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行回收、測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 APP生化試驗(yàn)及血清定型鑒定

APP生化特性見(jiàn)表1。乳糖、果糖、葡萄糖、硝酸鹽還原試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶、氧化酶、尿素酶和血漿凝固酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，甘露醇、山梨醇、鼠李糖、甘露糖、靛青質(zhì)、甲基紅、V-P、檸檬酸鹽和卵磷脂酶試驗(yàn)均為陰性。

表1 APP生化鑒定結(jié)果Tab.1 Bacterial biochemical identification results

經(jīng)過(guò)純化的細(xì)菌培養(yǎng)物分別與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，結(jié)果表明，1型占14.1% (12/85)、3型占8.2% (7/85)、7型占1.2% (1/85)、8型占5.9% (5/85)、9型占7.1% (6/85)、10型占24.7% (21/85)、12型占10.6% (9/85)和15型占3.5% (3/85)，未定型24.7% (21/85) 。

2.2 APP藥敏試驗(yàn)

根據(jù)抑菌圈直徑大小判定是否耐藥，其中抑菌圈≤11 mm判定為耐藥(R)，抑菌圈≥15 mm判定為敏感(S)，抑菌圈12～14 mm判定為中介(I)。85株試驗(yàn)菌株對(duì)大觀霉素和鏈霉素的耐藥率較高，分別為68.2%和60.0%，其次是卡那霉素(57.6%)、慶大霉素(55.3%)、新霉素(45.9%)、安普霉素(43.5%)、小諾霉素(37.6%) (表2)。

表2 85株APP對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的抑菌圈直徑Tab.2 The diameter of inhibition zone of 85 strains of APP against aminoglycoside antibiotics mm

續(xù)表2 85株APP對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的抑菌圈直徑Tab.2(Continued) The diameter of inhibition zone of 85 strains of APP against aminoglycoside antibiotics mm

2.3 APP對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

采用PCR方法對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素藥物耐藥基因(ant2-Ⅰa、aac3-Ⅱc、aac3-Ⅳ)進(jìn)行了檢測(cè)。85株放線桿菌的aac3-Ⅱc基因檢出49株，陽(yáng)性率為57.6%，aac3-Ⅳ基因檢出69株，陽(yáng)性率為81.2%，未檢測(cè)出ant2-Ⅰa基因。部分檢測(cè)結(jié)果的電泳圖譜見(jiàn)圖1和圖2。

M為DL2000 Marker；1—17為擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物M is DL2000 Marker；1—17 are PCR amplication products

M為DL2000 Marker；1—17為擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物 M is DL2000 Marker；1—17 are PCR amplication products

3 結(jié)論與討論

氨基糖苷類(lèi)藥物是臨床常用的一類(lèi)治療藥物，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，有的超量使用，造成細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)[12-13]。APP分為2個(gè)生物類(lèi)型，生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型毒力強(qiáng)，危害性大[14]。生物Ⅱ型中含有2個(gè)血清型(13、14)，主要分布于歐洲，其致病性比生物Ⅰ型要弱[15]。生物Ⅰ型中含有13個(gè)血清型(1—13)，其中血清5型又可分為2個(gè)亞型5a和5b[16-17]。血清型1、9和11，3、6和8，4和7含有共同的脂多糖(LPS)抗原[18]。在不同地方和地區(qū)，其流行的血清型也不同，如歐洲為血清型2、3和9；而北美地區(qū)的流行血清型為1、5和7。臺(tái)灣主要是血清型1和5。韓國(guó)主要是血清型2、3、4、5。日本主要為血清型2和5；我國(guó)主要是血清型1、5和7。

APP疫苗的保護(hù)作用取決于其質(zhì)量和免疫方法。目前已研制出胸膜肺炎滅活苗和亞單位苗。APP的血清型較多，至少15個(gè)，但互相之間的交叉免疫能力差，各血清型之間交叉保護(hù)性不強(qiáng)[19]。當(dāng)豬對(duì)APP某血清型的抗體一旦形成，再次接種其他血清型菌苗，則產(chǎn)生的抗體滴度很低[20]。感染APP后，經(jīng)過(guò)抗生素治療的豬常常持續(xù)帶菌，嚴(yán)重威脅著其他健康豬只，成為其他豬的傳染源。對(duì)發(fā)病的豬場(chǎng)，早期及時(shí)治療是提高療效的重要條件，需依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果和現(xiàn)場(chǎng)藥物使用情況確定具體藥物。

本研究分離的85株APP對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物產(chǎn)生了耐藥性，APP對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素藥物耐藥基因(aac3-Ⅱc)和(aac3-Ⅳ)的耐藥率分別為57.6%(49/85)、81.2%(69/85)；未檢測(cè)出ant2-Ⅰa耐藥基因。對(duì)APP防治的重點(diǎn)在于搞好豬舍的日常環(huán)境衛(wèi)生，采用全進(jìn)全出的飼養(yǎng)方式，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，創(chuàng)造良好的環(huán)境，減少各種應(yīng)激因素。保證全價(jià)優(yōu)質(zhì)的飼料，清潔的飲水。良好的通風(fēng)，合理的飼養(yǎng)密度，定期清理糞便、污水等污物，清潔干燥的圈舍，以?xún)艋諝?。?jiān)持抗體檢測(cè)，淘汰陽(yáng)性豬，凈化豬群。