常雨婷，任棋圓，李艷雙，王曉麗,，李 玉

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長春 130118; 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118)

黏菌在世界范圍內(nèi)數(shù)量較少，且個體微小不易觀察，一般多在腐爛潮濕的環(huán)境中生活，可生活在多種基質(zhì)上,包括腐木、落葉、土壤等,在生活史的不同階段分別具有類似真菌和動物的特征[1-2]，是一類不為人知的生物。黏菌的生活循環(huán)中，應(yīng)該具有以下4個典型的階段：原質(zhì)團、黏變形體、游動胞以及孢囊[3-5]。黏菌的生活周期有2個階段，分別是營養(yǎng)生長階段和繁殖階段。原質(zhì)團處于營養(yǎng)生長階段，是非細胞結(jié)構(gòu)，不具有細胞壁，當游動胞和黏變形體的數(shù)量達到臨界值時，性親和細胞相互接觸形成二倍體接合子[6-7]，接合子進行連續(xù)的有絲分裂但不進行胞質(zhì)分裂而轉(zhuǎn)變成多核變形體結(jié)構(gòu)，從而形成一層纖薄的原生質(zhì)膜和一個膠質(zhì)鞘包圍的一團原生質(zhì)。黏菌在分類學(xué)上屬于低等真核生物，也稱非細胞黏菌。現(xiàn)已證明在黏菌原質(zhì)團的細胞核骨架上存在有肌動蛋白，而且原質(zhì)團中也存在大量肌動蛋白，原質(zhì)團中團集的網(wǎng)體被認為是原質(zhì)團的骨架成分[8-10]，原質(zhì)團中存在的肌動蛋白是否參與形成骨架結(jié)構(gòu)尚無定論[11]。

原質(zhì)團主要可以分為3種類型，顯型原質(zhì)團(Phaneroplasmodium)、隱型原質(zhì)團(Aphanoplasmodium)和原始型原質(zhì)團(Protoplasmodium)[12]。其中，顯型原質(zhì)團，一般形狀明顯，體積較大，整體呈現(xiàn)微小顆粒狀結(jié)構(gòu)，是半流體狀態(tài)，具有膠黏性，伸展面的前端多呈現(xiàn)出扇形，邊緣清晰可見，后端多為網(wǎng)脈狀結(jié)構(gòu)，是一團具有攝食特性、多核、非細胞結(jié)構(gòu)的原生質(zhì)，具有極性，其內(nèi)部具有節(jié)律性的往返原生質(zhì)流[13]。原生質(zhì)流的流向總體方向是扇面端，引起反向原生質(zhì)流的原因是原質(zhì)團中凝膠物質(zhì)的堵塞和扇面端的尚未分化，也正是反向原生質(zhì)流形成了前緣的扇面，越是在原質(zhì)團的后部，反向流動的原生質(zhì)流越少。

微絲是由球形肌動蛋白單體形成的多聚體,在多數(shù)真核細胞中，是含量最豐富的蛋白質(zhì)之一，它參與了細胞微環(huán)境調(diào)節(jié)、變形運動、胞質(zhì)分裂、肌肉收縮、信號傳遞吞噬作用以及細胞遷移等許多重要的生物功能[14-15]。有關(guān)研究表明，肌動蛋白會影響雙孢蘑菇的基質(zhì)降解能力[16]。在真核細胞進化過程中，肌動蛋白保持著高度保守，肌動蛋白的分子裂縫使得蛋白分子在結(jié)構(gòu)上存在著不對稱性，微絲表面與微絲結(jié)合蛋白相互作用，形成了微絲的不同結(jié)構(gòu)，并表現(xiàn)出功能差異。肌動蛋白基因作為可用于植物界、動物界和真菌界分子系統(tǒng)學(xué)研究的一個重要基因，也被證明可用于真黏菌的系統(tǒng)發(fā)育研究[17]。

在原質(zhì)團中肌動蛋白的存在方式一直以來都存在著盲區(qū)，原質(zhì)團中有節(jié)律性的原生質(zhì)流是否是胞質(zhì)環(huán)流的另一種存在方式[18]，微絲是否參與了原生質(zhì)中細胞質(zhì)的運動，是值得深入探究的問題。鑒于此，研究微絲在黏菌顯型原質(zhì)團中的分布狀態(tài)及其生物學(xué)方式，以期實現(xiàn)從細胞核層面研究顯型原質(zhì)團的目的，為今后進一步研究黏菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料煤絨菌(Fuligoseptica)孢子由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)黏菌標本館提供，在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院遺傳實驗室條件下誘導(dǎo)萌發(fā)煤絨菌孢子，獲得煤絨菌顯型原質(zhì)團。

1.2 試驗方法

已獲得的煤絨菌顯型原質(zhì)團，在水瓊脂培養(yǎng)基上每天飼喂燕麥粉和無菌水。在moticSMA 168體視顯微鏡下，觀察煤絨菌顯型原質(zhì)團的遷移。制備煤絨菌顯型原質(zhì)團冰凍切片。細胞骨架綠色熒光探針ActinRed貯存含量200 U/mL,工作含量0.5 U/mL。煤絨菌原質(zhì)團冰凍切片，PBS洗滌2次，3.7%甲醛固定，室溫10 min，PBS洗滌2次，用含有0.1% TritonX-100的PBS洗滌3～5 min,PBS洗滌2次，用含有5%甲醇的PBS預(yù)染，含0.5 U/mL的5%甲醇染色20 min,PBS洗滌2次，室溫干燥，鏡檢。利用Adobe Photoshop CC 2017及 Auto CAD 2018 軟件進行系統(tǒng)建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 煤絨菌顯型原質(zhì)團培養(yǎng)過程

圖1是在實驗室條件下，煤絨菌孢子萌發(fā)獲得煤絨菌顯型原質(zhì)團的全過程。將野外采集的培養(yǎng)基物、松枝和樹皮等浸泡于無菌水12 h后，過濾煮沸后進行高溫滅菌，獲得噴施用營養(yǎng)液。將營養(yǎng)液冷卻至常溫，對煤絨菌孢子進行萌發(fā)培養(yǎng)。圖1A為煤絨菌子實體，圖1B為子實體結(jié)構(gòu)放大圖像，圖1C為顯微鏡下分散的孢子，圖1D中孢子開裂吐出黏變形體，圖1E為孢子產(chǎn)生游動細胞。黏變形體和游動細胞在條件適宜時形成初期顯型原質(zhì)團，如圖1F所示。對已獲得的顯型原質(zhì)團進行水瓊脂培養(yǎng)，每天飼喂燕麥粉及無菌水，圖1G為中期顯型原質(zhì)團，圖1H為后期顯型原質(zhì)團，圖1I為末期顯型原質(zhì)團，用于后續(xù)試驗。

A：煤絨菌子實體；B：子實體結(jié)構(gòu)放大圖像；C：分散的孢子；D：孢子開裂吐出黏變形體；E：孢子產(chǎn)生游動細胞；F：初期顯型原質(zhì)團；G：中期顯型原質(zhì)團；H：后期顯型原質(zhì)團；I：末期顯型原質(zhì)團A:Fruiting body of Fuligo septica;B:Structural enlargement of fruiting body;C:Scattered spores;D:Spores spit out myxamoebae;E:Spores produced swarm cell;F:Initial stage of phaneroplasmodium;G:Mid-term stage of phaneroplasmodium;H:Late stage of phaneroplasmodium;I:Terminal stage of phaneroplasmodium

2.2 煤絨菌顯型原質(zhì)團遷移連續(xù)過程

圖2顯示的是煤絨菌顯型原質(zhì)團菌脈前緣扇面端的一部分，在散射光、室溫22 ℃、時間間隔為30 min的條件下，呈現(xiàn)的是煤絨菌顯型原質(zhì)團遷移的連續(xù)過程。其中，顏色較暗的部分為煤絨菌顯型原質(zhì)團。煤絨菌顯型原質(zhì)團遷移過后，水瓊脂培養(yǎng)基向下出現(xiàn)凹陷，痕跡明顯，形態(tài)與煤絨菌顯型原質(zhì)團存在時相同，有著較清晰的脈絡(luò)網(wǎng)紋。白色圓圈為標志區(qū)域，當培養(yǎng)基養(yǎng)分匱乏時，煤絨菌顯型原質(zhì)團從圈中所示部位逐漸遷出，流向其他扇面端，完成全程遷徙過程僅需要1.5 h。

藍色圓圈標志區(qū)域在觀察過程中出現(xiàn)2次遷移，耗時5 h完成，具體表現(xiàn)為圖2A—B為遷移準備階段，無明顯變化；圖2C出現(xiàn)第1次明顯遷移，并看到發(fā)生遷移位置的原質(zhì)團脈絡(luò)；圖2D時原質(zhì)團脈絡(luò)遷移，可觀察到培養(yǎng)基表面凹陷；圖2E—G遷移過程中止，無明顯變化；圖2H—I時原質(zhì)團出現(xiàn)第2次遷移，并有脈絡(luò)出現(xiàn)；圖2J—L遷移過程結(jié)束，無明顯變化。圖2A中原質(zhì)團最內(nèi)側(cè)脈絡(luò)于2 h后完全消失，表明原質(zhì)團遷移是一個動態(tài)過程。

A—B：遷移準備階段；C：第1次遷移過程，可見原質(zhì)團脈絡(luò)；D：原質(zhì)團脈絡(luò)遷移,培養(yǎng)基表面凹陷；E—G：遷移過程中止；H—I：第2次遷移過程，有脈絡(luò)出現(xiàn)；J—L：遷移過程結(jié)束A—B:Migration preparation phase;C:First migration process,phaneroplasmodium context was visible;D:The phaneroplasmodium context migrated,and the surface of the medium was sunken;E—G:Migration process suspended;H—I:Second migration process,context appeared;J—L:The migration process ended

根據(jù)Adobe Photoshop CC 2017及 Auto CAD 2018 軟件進行系統(tǒng)建模的結(jié)果，對圖2中的白色和藍色標志陰影部分進行面積計算。如表1所示，原質(zhì)團的遷徙過程中會出現(xiàn)回縮現(xiàn)象，流動狀態(tài)具有節(jié)律性，在到達扇面前端后，會向著相反的方向流動。

表1 黏菌煤絨菌顯型原質(zhì)團標志陰影部分面積變化Tab.1 The shaded area change of markings of phaneroplasmodium of Fuligo septica

2.3 煤絨菌顯型原質(zhì)團微絲分布狀態(tài)

圖3是煤絨菌顯型原質(zhì)團冰凍切片后，原質(zhì)團中微絲被熒光染色后的存在狀態(tài)。圖3A—B是沒有經(jīng)過TritonX-100處理的原質(zhì)團微絲結(jié)構(gòu)，其中微絲呈現(xiàn)交叉的網(wǎng)狀，微絲可能是原質(zhì)團中團集的網(wǎng)體的組成成分。圖3C—E是經(jīng)過TritonX-100處理的原質(zhì)團微絲結(jié)構(gòu)，微絲呈現(xiàn)明顯的亮綠色。圖3D—F分別是圖3C—E的區(qū)域放大圖像，在圖3C—E中，團集的網(wǎng)體明顯消失，在菌脈中，近似內(nèi)質(zhì)和外質(zhì)的交界處出現(xiàn)了連續(xù)排列的微絲束。

A—B:未經(jīng)過TritonX-100處理的原質(zhì)團微絲結(jié)構(gòu);C—E:經(jīng)過TritonX-100處理的原質(zhì)團微絲結(jié)構(gòu);D—F:C、E的區(qū)域放大圖像A—B:Phaneroplasmodium microfilament structure without TritonX-100 treatment;C—E:Phaneroplasmodium microfilament structure with TritonX-100 treatment;D—F:The enlarged image of the area in Fig.C and E

3 結(jié)論與討論

在植物細胞中，細胞質(zhì)的流動是圍繞中央液泡進行的環(huán)形模式，細胞周質(zhì)區(qū)的細胞質(zhì)是相當穩(wěn)定、不流動的，只是靠內(nèi)層部分的胞質(zhì)溶膠在流動，在能流動的不流動細胞質(zhì)層面有大量微絲平行排列，會同葉綠體通過細胞膜蛋白和細胞骨架系統(tǒng)的連接錨定在一起，增強了細胞承受機械力的能力。胞質(zhì)環(huán)流是由肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，通過水解、分解反應(yīng)將生物化學(xué)能轉(zhuǎn)化為動能引起的。微絲具有極性，在生物體中，由肌動蛋白單體組裝成為微絲的過程中，發(fā)生成核反應(yīng)，當肌動蛋白單體到達臨界濃度時，微絲會進行自發(fā)組裝。在植物細胞中，肌動蛋白的排列方向是相同的，正向朝向流動的方向，這決定了原生質(zhì)的運動方向。在動物細胞中，如果蠅卵母細胞中,細胞周質(zhì)區(qū)的細胞質(zhì)穩(wěn)定不流動,周質(zhì)區(qū)以外的細胞質(zhì)處于流動狀態(tài)，微絲平行排列于流動與不流動的細胞質(zhì)交界層面。

在分類學(xué)上，黏菌屬于低等真核生物，和其他真核生物具有相同的生物學(xué)現(xiàn)象[19-20]。原質(zhì)團表面膠黏質(zhì)的鞘中含有微纖絲，與微絲是否為同一物質(zhì)，尚有待進一步研究。顯型原質(zhì)團中團集的網(wǎng)體的成分之一應(yīng)該是微絲，可能與微管蛋白共同作用完成一系列的生物學(xué)行為。TritonX-100是非離子去垢劑，可以消解部分蛋白質(zhì)，利用TritonX-100作用于顯型原質(zhì)團表面的膠黏質(zhì)鞘后，交織的微絲消失，可能是肌動蛋白單體低于臨界濃度，微管蛋白發(fā)生解聚現(xiàn)象。

通過對全白絨泡菌的研究表明[21]，對于一個寬度在200 μm左右的菌脈來說，兩側(cè)的凝膠外質(zhì)各占三分之一，中間大約有三分之一為溶膠內(nèi)質(zhì)。通過TritonX-100處理后微絲存在的位置，大約介于凝膠和溶膠的交界處。細胞骨架綠色熒光探針ActinRed是熒光染料四甲基羅丹明(TRITC)標記的鬼筆環(huán)肽(Rhodamine-Phalloidin)，與微絲有強烈的親和作用。微絲是肌動蛋白的多聚體，雖然對微絲的結(jié)構(gòu)尚有爭議[22]，但直徑大約都在7 nm，在普通的光學(xué)顯微鏡下難以觀察。本研究對煤絨菌顯型原質(zhì)團進行冰凍切片后，觀察到大量平行排列的微絲束。原質(zhì)團中微絲被熒光染色后的存在狀態(tài)，呈現(xiàn)出明顯交叉網(wǎng)狀，所以微絲可能是原質(zhì)團中團集網(wǎng)體的組成成分。

本研究通過培養(yǎng)煤絨菌孢子得到顯型原質(zhì)團，對顯型原質(zhì)團進行連續(xù)培養(yǎng)，得到了煤絨菌顯型原質(zhì)團的遷移特點。對顯型原質(zhì)團進行熒光染色冰凍切片，發(fā)現(xiàn)在煤絨菌顯型原質(zhì)團中存在著微絲結(jié)構(gòu)，在顯型原質(zhì)團中觀察到大量平行排列的微絲束，并進一步得出，微絲存在的位置在菌脈的凝膠外質(zhì)和溶膠內(nèi)質(zhì)的交界處，呈現(xiàn)出明顯交叉網(wǎng)狀。微絲在顯型原質(zhì)團的分布狀態(tài)，為黏菌原質(zhì)團肌動蛋白參與了原生質(zhì)流的運動提供了有力細胞學(xué)證據(jù)，判斷出微絲可能是原質(zhì)團中團集網(wǎng)體的組成成分。