鄧 依，袁 月，張瀟月，張 雪，劉路宏

（四川宜賓五糧液集團(tuán)公司質(zhì)量檢測(cè)中心，四川宜賓 644007）

吖啶（Acridine）及其衍生物是現(xiàn)代工業(yè)中常用的有機(jī)染料和高級(jí)顏料[1]。吖啶通常為無(wú)色固體，易溶于酒精等有機(jī)溶劑，分子式為C13H9N，主要產(chǎn)自石油精餾過(guò)程[2]。吖啶為含氮(N)的雜環(huán)化合物，其分子中含兩個(gè)苯環(huán)和一個(gè)吡啶環(huán)，為偏平式分子結(jié)構(gòu)，可螯合進(jìn)DNA 分子的堿基對(duì)從而引起基因突變[3]。吖啶及其衍生物因其獨(dú)特的顏色性能和不含重金屬的特點(diǎn)，在食品安全日益被消費(fèi)者關(guān)注的今天，廣泛用于染料行業(yè)、顏料行業(yè)，在食品周邊如食品包裝等行業(yè)逐步取代傳統(tǒng)的有機(jī)染料和有機(jī)顏料[4-6]。酒在其生產(chǎn)過(guò)程中存在接觸吖啶類有機(jī)染料和有機(jī)顏料的可能性，從而存在被吖啶類有害物質(zhì)污染的可能[7]。

目前對(duì)酒中吖啶含量檢測(cè)的分析方法較少，目前主要有液相色譜-熒光法[8]，另外本研究開(kāi)發(fā)出用于檢測(cè)酒中吖啶含量分析的液相色譜-紫外吸收法和液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜法。本文分別從靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度和樣品加標(biāo)回收等方面對(duì)3 種分析方法的可行性和實(shí)用性進(jìn)行比較研究，為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室選擇合適的分析方法提供選擇依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：來(lái)源主要有啤酒、雞尾酒、果酒、黃酒、葡萄酒、白酒，均購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

試劑及耗材：甲醇為色譜級(jí)，德國(guó)Merck 公司；乙酸為ACS 級(jí)試劑，北京百靈威科技有限公司；甲酸為L(zhǎng)C/MS 級(jí)，美國(guó)ThermoFisher 公司；乙醇為色譜級(jí)，德國(guó)Merck 公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純?nèi)ルx子水；吖啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為，純度98%，上海阿拉丁試劑有限公司。

儀器設(shè)備：液相色譜儀（MultiMate 3000 標(biāo)準(zhǔn)四元系統(tǒng)，熒光檢測(cè)器，Chromeleon 7.0 數(shù)據(jù)處理軟件）美國(guó)ThermoFisher 公司；液相色譜儀（Multi-Mate 3000 標(biāo)準(zhǔn)四元系統(tǒng)，紫外吸收檢測(cè)器，Chromeleon 7.0 數(shù)據(jù)處理軟件）美國(guó)ThermoFisher公司；液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（MSQ-plus，Chromeleon 6.0 數(shù)據(jù)處理軟件）美國(guó)ThermoFisher公司；QUINTIX224 型電子分析天平，德國(guó)SI Analytics 公司；INTEGRAL 3 型純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜-熒光法

1.2.1.1 樣品制備

白酒、葡萄酒、果酒、黃酒等不含氣體酒樣直接過(guò)0.22 μ m 孔徑的有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾，即為待測(cè)液，可直接進(jìn)樣分析或用去離子水稀釋后進(jìn)樣分析；啤酒、雞尾酒等含有氣體的酒需用超聲法除去溶解二氧化碳后，再過(guò)0.22 μ m 孔徑的有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾便為待測(cè)液體，可直接進(jìn)樣分析或用去離子水稀釋后進(jìn)樣分析。

1.2.1.2 儀器分析方法

色譜柱：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μ m）；流動(dòng)相，甲醇∶水（含乙酸0.1 %）為80∶20；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μ L；熒光激發(fā)光波長(zhǎng)：248 nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)447 nm，流通池溫度45 ℃，采用外標(biāo)法定量。

1.2.2 液相色譜-紫外吸收法

樣品處理方法同1.2.1.1，色譜柱、流動(dòng)相、流速、柱溫、進(jìn)樣量同1.2.1.2；紫外吸收波長(zhǎng)為248.1 nm、356.0 nm、208.7 nm，采用外標(biāo)法定量。

1.2.3 液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜法

1.2.3.1 樣品制備

白酒樣品經(jīng)0.22 μ m 孔徑的有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾即為待測(cè)液；取葡萄酒、果酒、黃酒等不含氣體酒樣品5 mL 于離心管中，并加入5 mL 乙醚密封后渦旋振蕩萃取2 min，并于4 ℃下以15000 r/min 的速度離心5 min，取上清液2 mL，氮?dú)獯蹈珊蠹尤? mL 甲醇溶解，經(jīng)0.22 μ m 孔徑的有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾即為待測(cè)液；啤酒、雞尾酒等汽酒需先超聲除氣后再進(jìn)行上述萃取步驟，即為待測(cè)液。以上待測(cè)液可直接進(jìn)樣分析或用去離子水稀釋后進(jìn)樣分析。

1.2.3.2 儀器分析方法

色譜條件：色譜柱：C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μ m），流動(dòng)相為甲醇+水（含甲酸0.1%）為80+20，流速0.2 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL；質(zhì)譜條件：采用ESI 離子源正模式掃描，Cone 電壓為50 eV，探針溫度為400 ℃，特征離子為180 Da，采用外標(biāo)法定量。

1.2.4 計(jì)算方法

靈敏度：在最低濃度標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖上，以標(biāo)準(zhǔn)峰保留時(shí)間為中心，保留時(shí)間跨度為2 min 的范圍內(nèi)尋找最大的噪聲峰，以該噪聲峰峰高的3 倍除以最低濃度標(biāo)準(zhǔn)品峰的峰高，乘以該標(biāo)準(zhǔn)品濃度，為該法吖啶的最低檢測(cè)濃度，即該檢測(cè)方法的靈敏度[9]。

準(zhǔn)確度：以體積比為1∶1 的乙醇水溶液為基體，配制已知濃度的樣品，分別用3 種檢測(cè)方法分析每份配制樣品中吖啶的濃度，進(jìn)行2 次平行試驗(yàn)，取2 次平行試驗(yàn)的平均值即為檢測(cè)值，檢測(cè)值與配制濃度差值的絕對(duì)值與配制濃度的比值應(yīng)小于10%。

精密度：取一種酒樣品為基體配制已知濃度的樣品，分別用3種檢測(cè)方法進(jìn)行分析配制。

樣品中吖啶的濃度，進(jìn)行6 次獨(dú)立試驗(yàn)，計(jì)算6次檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，RSD 應(yīng)小于10%。樣品加標(biāo)回收：取6種酒樣品各3份，分別添加低、中、高3 種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，用3 種檢測(cè)方法分別測(cè)定原樣以及加標(biāo)樣品中吖啶的濃度，并分別計(jì)算加標(biāo)回收率。樣品回收率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性

液相色譜-熒光法中樣品未進(jìn)行復(fù)雜處理，基本屬于直接進(jìn)樣模式，故標(biāo)準(zhǔn)品基體選擇50 %乙醇水溶液，檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)熒光檢測(cè)器定量法靈敏度較高，當(dāng)進(jìn)樣量為2 pg～2 ng 時(shí)有良好的線性關(guān)系，最終配制的工作溶液為0.1 μ g/L，1.0 μ g/L、

10.0 μ g/L、20.0 μ g/L、50.0 μ g/L、80.0 μ g/L、100.0 μ g/L。線性回歸方程中Y 為熒光強(qiáng)度，X 為樣品中吖啶的濃度（μ g/L）。

液相色譜-紫外吸收法基本儀器條件同液相色譜-熒光法，采用DAD 檢測(cè)器，分別采用了吖啶紫外吸收?qǐng)D譜中3 個(gè)吸收峰處的紫外波長(zhǎng)（208.71 nm、248.15 nm、356.05 nm）作為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，發(fā)現(xiàn)以248.15 nm 和356.05 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)工作液的吸光度與樣品中吖啶的濃度呈良好的線性關(guān)系，其中采用248.15 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，當(dāng)進(jìn)樣量為200 pg～200 ng 區(qū)間均有良好的線性關(guān)系，線性范圍較寬，最終配制的工作溶液為10.0 μ g/L、50.0 μ g/L、100.0 μ g/L、150.0 μ g/L、200.0 μ g/L、250.0 μ g/L、300.0 μ g/L。線性回歸方程中Y 為吸光強(qiáng)度，X 為樣品中吖啶的濃度（μ g/L）。

在質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)吖啶分子結(jié)構(gòu)較為溫度，不容易碎片化，故僅可采用母離子為特征離子。在液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜法中吖啶的離子強(qiáng)度與樣品中吖啶的濃度僅在進(jìn)樣量為50～500 pg區(qū)間線性關(guān)系良好，線性范圍較窄，最終配制的工作溶液為10.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L、200.0 μg/L、400.0 μg/L、600.0 μg/L。線性回歸方程中Y為180 Da離子的強(qiáng)度，X為樣品中吖啶的濃度（μ g/L）。

3 種檢測(cè)方法中，液相色譜-熒光法靈敏度最高，液相色譜-熒光法和液相色譜-紫外吸收法線性范圍較寬，而液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜法線性范圍最窄，如表1。

2.2 3種方法的檢出限

在最低濃度標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖上，以標(biāo)準(zhǔn)峰保留時(shí)間為中心，保留時(shí)間跨度為2 min 的范圍內(nèi)尋找最大的噪聲峰，以該噪聲峰峰高的3 倍除以最低濃度標(biāo)準(zhǔn)品峰的峰高，乘以該標(biāo)準(zhǔn)品濃度，為該法吖啶的最低檢測(cè)濃度，即該檢測(cè)方法的靈敏度。

3 種方法的檢出限均由3 倍噪聲處對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)計(jì)算公式QL=3Sn*C1/S1，其中QL為檢出限，Sn為目標(biāo)物色譜/質(zhì)譜峰附近最高噪聲峰的響應(yīng)值，C1 為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)對(duì)應(yīng)的吖啶濃度，液相色譜—熒光法中為0.1 μ g/L，液相色譜—紫外吸收法中和液相色譜—單四級(jí)桿質(zhì)譜法中均為10 μ g/L，S1為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的響應(yīng)值。3種方法的檢出限分別為0.083 μg/L、2.2 μg/L、4.7 μg/L，見(jiàn)表1。

表1 3種檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

2.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)（表2）

從表2 數(shù)據(jù)可見(jiàn)，3 種檢測(cè)方法測(cè)定的相對(duì)誤差分別為-1.1%、9.0%和-9.3%，均滿足絕對(duì)值不高于10%的要求，3 種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度滿足測(cè)量要求，且液相色譜-熒光法準(zhǔn)確度高于另外兩法。液相色譜-紫外吸收法為正偏離，液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜法為負(fù)偏離，二者準(zhǔn)確度相當(dāng)。

2.4 精密度試驗(yàn)（表3）

精密度試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可見(jiàn)，3種檢測(cè)方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10 %，滿足測(cè)量要求。其中液相色譜-熒光法與液相色譜-紫外吸收法精密度較好，均小于5%。

2.5 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)（表4—表9）

表4—表9 為6 種不同酒樣品的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果。從表中數(shù)據(jù)可見(jiàn)，液相色譜-熒光法的樣品加標(biāo)回收率為80 %～118 %，平均回收率為95 %，低、中、高濃度的加標(biāo)回收率分別為91 %、97 %和96%；液相色譜-紫外吸收法的樣品加標(biāo)回收率為42 %～102 %，平均回收率為81 %，低、中、高濃度的加標(biāo)回收率分別為66 %、86 %和91 %；液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜法的樣品加標(biāo)回收率為68 %～92%，平均回收率為82%，低、中、高濃度的加標(biāo)回收率分別為76 %、84 %和85 %。在低濃度的加標(biāo)回收試驗(yàn)中液相色譜-熒光法高于其他二法，而液相色譜-紫外吸收法對(duì)低濃度的加標(biāo)回收率最低，平均不足70 %。液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜法加標(biāo)匯率較穩(wěn)定，但最高只有92%，考慮到因前處理過(guò)程中損失所致，可采用內(nèi)標(biāo)法解決加標(biāo)回收率偏低的問(wèn)題。

表2 3種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度

表3 3種檢測(cè)方法的精密度

表4 葡萄酒樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表5 果酒樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表6 黃酒樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表7 啤酒樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表8 雞尾酒樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表9 白酒樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表10 3種酒中吖啶含量測(cè)定方法的比較

由表4—表9 可看出，3 種方法對(duì)于白酒的加標(biāo)回收率普遍良好，優(yōu)于其他5 種樣品。以上6 種樣品中僅白酒為蒸餾酒，且為無(wú)色飲料。而對(duì)于含糖量較高的果酒和雞尾酒普遍加標(biāo)回收率較低。從而初步懷疑樣品中的色素和糖類物質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)有一定影響。

2.6 3種方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

本研究對(duì)酒中吖啶含量的3 種不同檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比研究，比對(duì)的結(jié)果如表10 所示。結(jié)果表明，液相色譜-熒光法靈敏度較高，變異系數(shù)、相對(duì)誤差以及加標(biāo)回收率均滿足要求。液相色譜-熒光法靈敏度較高，樣品前處理過(guò)程較為簡(jiǎn)單，在準(zhǔn)確度、精密度和加標(biāo)回收方面表現(xiàn)優(yōu)秀，試驗(yàn)中使用過(guò)的樣品種類暫未發(fā)現(xiàn)有干擾物存在，適合作為權(quán)威檢測(cè)方法，但在葡萄酒樣品檢測(cè)方面精準(zhǔn)度略差。同液相色譜-熒光法相比，液相色譜-紫外吸收法相同的簡(jiǎn)易前處理和較短的單樣分析耗時(shí)，但在低濃度樣品檢測(cè)方面效果較差，檢測(cè)設(shè)備價(jià)格也更便宜。此二法均適合進(jìn)行大批量檢測(cè)和快速篩查工作。液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜法在各方面稍微遜于另外兩種方法，單樣消耗時(shí)間也較長(zhǎng)，但不受限于樣品種類，對(duì)于深色樣品也有較好的加標(biāo)回收率，且定性效果更準(zhǔn)確，適合對(duì)篩查的陽(yáng)性樣品進(jìn)行精準(zhǔn)定性。

3 結(jié)論

由此可以看出，液相色譜-熒光法、液相色譜-紫外吸收法和液相色譜-單四級(jí)桿質(zhì)譜法在測(cè)定酒中吖啶含量時(shí)，方法的準(zhǔn)確性，精密度和加標(biāo)回收率均能滿足檢測(cè)需求，每種方法均有自己的優(yōu)勢(shì)。在實(shí)際應(yīng)用中，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際檢測(cè)需求進(jìn)行選取合適的分析方法。