秦連進(jìn) 唐成武

[摘要] 目的 探討肝癌組織中LncRNA TINCR表達(dá)水平對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的影響。 方法 回顧性分析2014年7月～2016年7月間在我院接受手術(shù)治療的132例肝細(xì)胞癌患者的臨床資料。RT-PCR 法檢測(cè)肝癌標(biāo)本內(nèi)LncRNA TINCR表達(dá)水平，采用ROC曲線和Kaplan-Meier法分析LncRNA TINCR表達(dá)水平對(duì)肝癌術(shù)后長(zhǎng)期生存的影響。 結(jié)果 肝癌組織中LncRNA TINCR表達(dá)水平對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的曲線下面積（AUC）為 0.818，特異度為72.73%，敏感度為83.12%，最佳判讀值為1.82（P<0.0001）。根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果，將肝癌組織LncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)水平>1.82的81例（61.36%）患者納入高表達(dá)組，而肝癌組織LncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)水平≤1.82的51例（38.64%）患者納入低表達(dá)組。Kaplan-Meier法生存分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)組術(shù)后3年內(nèi)有65例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，3年無瘤生存率為19.75%（16/81）;低表達(dá)組術(shù)后3年內(nèi)有12例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，3年無瘤生存率為76.47%（39/51），低表達(dá)組3年無瘤生存率明顯高于高表達(dá)組（P<0.0001），兩組間死亡風(fēng)險(xiǎn)比：5.5717，95%CI：3.5642～8.7100。 結(jié)論 肝癌組織LncRNA TINCR表達(dá)水平與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，LncRNA TINCR表達(dá)水平升高則預(yù)示術(shù)后較高的復(fù)發(fā)率。

[關(guān)鍵詞] 肝細(xì)胞癌;肝切除;復(fù)發(fā);LncRNA TINCR

[中圖分類號(hào)] R735.7 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）26-0034-04

[Abstract] Objective To explore the effect of LncRNA TINCR expression level in liver cancer tissue on postoperative recurrence. Methods ?The clinical data of 132 patients with hepatocellular carcinoma who underwent surgery in our hospital from July 2014 to July 2016 were retrospectively analyzed. RT-PCR method was used to detect the expression level of LncRNA TINCR in liver cancer specimens. ROC curve and Kaplan-Meier method were used to analyze the effect of LncRNA TINCR expression level on long-term survival of liver cancer after operation. Results The area under the curve（AUC） of LncRNA TINCR expression level of liver cancer tissues for postoperative recurrence prediction was 0.818， specificity was 72.73%， sensitivity was 83.12%， and the best interpretation value was 1.82（P<0.0001）. According to the results of ROC curve analysis， 81（61.36%） patients with a relative expression level of LncRNA TINCR greater than 1.82 were included in the high expression group， while 51（38.64%） patients with a relative expression level of LncRNA TINCR less than 1.82 were included in the low expression group. Kaplan-Meier method survival analysis found that 65 patients in the high expression group had recurrence within 3 years after operation， and the 3-year tumor-free survival rate was 19.75%（16/81）. Twelve patients in the low expression group had recurrence within 3 years after operation， and the 3-year tumor-free survival rate was 76.47%（39/51）. The 3-year tumor-free survival rate of the low expression group was significantly higher than that of the high expression group（P<0.0001）， The mortality risk ratio between the two groups was 5.5717， with 95% confidence interval of 3.5642-8.7100. Conclusion The expression level of LncRNA TINCR in liver cancer tissue is significantly correlated with the recurrence of liver cancer after surgery， and the increased expression level of LncRNA TINCR indicates a higher probability of postoperative recurrence.

[Key words] Hepatocellular carcinoma; Hepatectomy; Recurrence; LncRNA TINCR

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular cancer，HCC）目前仍是嚴(yán)重危害國(guó)民健康的重大公共衛(wèi)生難題[1-3]，全世界超過一半的新發(fā)HCC病例和死亡病例發(fā)生在我國(guó)。雖然針對(duì)HCC的治療有了長(zhǎng)足的發(fā)展，但是根治手術(shù)仍是治療HCC最理想的治愈措施之一[4]。由于我國(guó)大部分HCC發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，甚至已侵犯膽道及門脈系統(tǒng)，因此術(shù)后復(fù)發(fā)率高，總體預(yù)后很不理想[5-6]。目前亟需進(jìn)一步探討引起HCC術(shù)后復(fù)發(fā)易感因素和靶點(diǎn)，從根本上阻斷HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的通路，達(dá)到改善預(yù)后的目的。終末分化誘導(dǎo)非編碼RNA（Terminal differentiation-induced lncRNA，TINCR）是從人類分化的體細(xì)胞中分離得到的一個(gè)長(zhǎng)3.7 kb 的LncRNA轉(zhuǎn)錄本[7]。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA TINCR在肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、胃癌、鱗狀細(xì)胞癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等惡性腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)異常，并與多種分子相互作用而影響基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后過程，可加速腫瘤的發(fā)展[8-11]。本研究旨在探討肝細(xì)胞癌組織中LncRNA TINCR表達(dá)水平對(duì)HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

回顧性研究 2014年7月～2016年7月間在我院接受手術(shù)切除的132例HCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)[12]：未接受任何抗癌治療;非彌漫性HCC;術(shù)后隨訪6個(gè)月及以上;無失訪情況;所有治療經(jīng)患者本人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前已有肝外轉(zhuǎn)移;術(shù)后隨訪短于6個(gè)月。

1.2 HCC組織LncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

采用Tissue RNA Kit 提取HCC組織RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，用于RT-PCR 檢測(cè)組織中TINCR 相對(duì)表達(dá)量，試劑盒均購(gòu)自南京東極醫(yī)藥科技有限公司，操作過程嚴(yán)格參照說明書進(jìn)行。TINCR 上游引物為5'-CCATCCCTCTGTAACCACCT-3'，下游引物為5'-GTTGGGTCTAGATTCCAGCA-3'，以Actin 為內(nèi)參，Actin上游引物為5'-ATCATGTTTGCCTAGATCAACA-3'，下游引物為5'-CATCTCTTGCTAAGCGTCCA-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。RT-PCR 程序：95℃預(yù)變性10 min;95℃ 10 s，60℃ 35 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

1.3 隨訪及觀察指標(biāo)

術(shù)后半年內(nèi)每月進(jìn)行隨訪，之后每3個(gè)月1次。隨訪內(nèi)容包括體格檢查、血常規(guī)、生化及腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)，如有可疑復(fù)發(fā)，需行超聲、增強(qiáng)CT、MRI，必要時(shí)行腸鏡及穿刺活檢確認(rèn)。一旦確認(rèn)腫瘤復(fù)發(fā)，記錄復(fù)發(fā)的時(shí)間及部位。無瘤生存時(shí)間定義為自手術(shù)開始直至首次發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)、死亡（復(fù)發(fā)前）或最后一次隨訪（復(fù)發(fā)前）。比較兩組3年無瘤生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)均由MEDCALC 15.2軟件完成，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。LncRNA TINCR表達(dá)對(duì)術(shù)后生存的預(yù)測(cè)作用采用ROC 曲線分析。Kaplan-Meier法繪制患者無瘤生存情況曲線，采用Log-rank法分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織LncRNA TINCR表達(dá)水平對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值

將HCC組織LncRNA TINCR表達(dá)水平與術(shù)后復(fù)發(fā)情況（無復(fù)發(fā)=0，復(fù)發(fā)=1）繪制ROC曲線（圖1），并計(jì)算得出曲線下面積（AUC）為 0.818，特異度為72.73%，敏感度為83.12%，最佳判讀值為1.82（P<0.0001）。

2.2 HCC組織LncRNA TINCR表達(dá)對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的影響

將HCC組織LncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)水平>1.82（ROC曲線所得的最佳判讀值）的81例（61.36%）患者納入高表達(dá)組，而將HCC組織LncRNA TINCR相對(duì)表達(dá)水平≤1.82的51例（38.64%）患者納入低表達(dá)組。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)兩組患者的一般資料無顯著性差異（P>0.05）（表1）。高表達(dá)組術(shù)后3年內(nèi)有65例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，3年無瘤生存率為19.75%（16/81）;低表達(dá)組術(shù)后3年內(nèi)有12例患者死亡，3年無瘤生存率為76.47%（39/51）。Log-rank法分析生存曲線發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)組3年無瘤生存率明顯高于高表達(dá)組（P<0.0001），兩組間復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)比：5.5717，95%CI：3.5642～8.7100。（圖2）。

3 討論

HCC目前仍是嚴(yán)重危害國(guó)民健康的重大公共衛(wèi)生難題[1-3]，全世界超過一半的新發(fā)HCC病例和死亡病例發(fā)生在我國(guó)。雖然針對(duì)HCC的治療有了長(zhǎng)足的發(fā)展，但是根治手術(shù)仍是治療HCC最理想的治愈措施之一[4]。由于在我國(guó)大部分HCC發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，甚至已經(jīng)侵犯膽道及門脈系統(tǒng)，因此術(shù)后復(fù)發(fā)率高，總體預(yù)后很不理想[5-6]。目前亟需進(jìn)一步探究引起HCC術(shù)后復(fù)發(fā)易感因素和靶點(diǎn)，以改善HCC患者預(yù)后。

新一代的基因測(cè)序技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過90%的人類基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一系列非蛋白編碼（非編碼）RNA（ncRNA）[13-14]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）大于200核苷酸長(zhǎng)度，雖然不具有蛋白質(zhì)編碼功能，卻能顯著影響生物學(xué)過程[15]。與microRNA相比，LncRNA的功能及機(jī)制尚未完全被人類掌握。然而，近年來人們對(duì)LncRNA的研究越來越深入。目前已經(jīng)證實(shí)LncRNA能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理活動(dòng)，包括染色質(zhì)修飾，基因印跡，選擇性剪接，基因組重排，細(xì)胞增殖、遷移、凋亡以及核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等[16]。研究表明，LncRNA參與了廣泛的生理及病理生理過程，通過正反饋/負(fù)反饋通路在癌癥發(fā)生發(fā)展中起到促癌或抑癌基因的作用[17]。也有證據(jù)顯示LncRNA與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)[18-19]。因此，LncRNA有望成為腫瘤診斷標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)。

終末分化誘導(dǎo)非編碼RNA（Terminal differentiation-induced lncRNA，TINCR）是從人類分化的體細(xì)胞中分離得到的一個(gè)長(zhǎng)3.7 kb 的LncRNA轉(zhuǎn)錄本[20]。研究發(fā)現(xiàn)TINCR在肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、胃癌、鱗狀細(xì)胞癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等表達(dá)異常，TINCR與多種分子相互作用而影響基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后過程，可加速腫瘤的發(fā)展[8-11，21]。

近年來關(guān)于LncRNA TINCR 在HCC起源和進(jìn)展中的作用機(jī)制及LncRNA TINCR的信號(hào)通路越來越受到關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)，HCV所致的肝硬化后HCC組織中LncRNA TINCR的表達(dá)較正常肝組織明顯升高[22]。有學(xué)者將HCC組織中的LncRNA TINCR的表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期及血管浸潤(rùn)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果兩者相關(guān)性緊密，而進(jìn)一步的生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的患者術(shù)后無瘤生存率明顯低于低表達(dá)患者，從而推測(cè)LncRNA TINCR表達(dá)升高能增加腫瘤侵襲性，并能促進(jìn)HCC術(shù)后進(jìn)展[10]。

在本次研究中，HCC組織LncRNA TINCR表達(dá)水平對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線下面積（AUC）為 0.818，特異度為72.73%，敏感度為83.12%，最佳判讀值為1.82 （P<0.0001）。通過此結(jié)果，將患者分為L(zhǎng)ncRNA TINCR高表達(dá)組和LncRNA TINCR低表達(dá)組，Log-rank法分析生存曲線發(fā)現(xiàn)低表達(dá)組3年無瘤生存率明顯優(yōu)于高表達(dá)組（P<0.0001）。

已有研究顯示，LncRNA TINCR能作為競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合microRNA（competing endogenous RNA，ceRNA）調(diào)控基因表達(dá)，其不但可活化某些蛋白編碼基因表達(dá)，亦可以抑制蛋白編碼基因的表達(dá)[23-25]。目前已經(jīng)證實(shí)，LncRNA TINCR能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-375，從而下調(diào)miR-375表達(dá)，起到促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用，而大量研究表明miR-375在HCC中發(fā)揮抑制腫瘤的功能[26-27]。因此，可以推測(cè)通過降低LncRNA TINCR水平能增加miR-375表達(dá)，從而抑制HCC進(jìn)展，能顯著改善HCC預(yù)后。

此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)LncRNA TINCR， ROCK1（Rho相關(guān)蛋白激酶1）和 miR-214-5p三者間存在交互影響。ROCK1在多種腫瘤中過度表達(dá)，并能通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等行為來促進(jìn)腫瘤發(fā)展，而miR-214-5p可通過直接靶向下調(diào)ROCK1表達(dá)，起到抑制腫瘤增殖的作用[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中既有ROCK1的上調(diào)又有miR-214-5p的下調(diào)。因此推測(cè)LncRNA TINCR可能通過吸附作用下調(diào)miR-214-5p在HCC中表達(dá)，從而上調(diào)ROCK1，起到促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用[29]。

綜上所述，HCC組織LncRNA TINCR表達(dá)水平與HCC術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系緊密，LncRNA TINCR表達(dá)水平升高則預(yù)示著較高的復(fù)發(fā)率，因此LncRNA TINCR可能是降低HCC術(shù)后復(fù)發(fā)率的有效治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2020-02-13）