陳奕凝 譚文文 彭冶 白瑪玉珍 楊美鈺 劉從敏 嚴(yán)袖

摘要 為了比較不同海棠葉表皮結(jié)構(gòu)的差異并選擇出最佳觀察方法，選取西府海棠（Malus micromalus）、湖北海棠（Malus hupehensis）及垂絲海棠（Malus halliana），使用撕取法、指甲油印跡法、白膠印跡法、氫氧化鈉離析法及水楊酸甲酯透明法，對(duì)不同種海棠的葉表皮進(jìn)行觀察比較并以撕取法為對(duì)照對(duì)不同方法進(jìn)行歸納總結(jié)。結(jié)果顯示：3種海棠葉片上下表皮結(jié)構(gòu)基本相似，上表皮均具有蠟質(zhì)紋飾，氣孔器均為不規(guī)則類型。湖北海棠的葉片結(jié)構(gòu)和垂絲海棠較相似，其表皮細(xì)胞數(shù)據(jù)受方法影響不大。撕取法的清晰度最高;指甲油印跡法操作方便，但會(huì)使表皮細(xì)胞產(chǎn)生皺縮，不同類型的指甲油試驗(yàn)結(jié)果存在差異;白膠印跡法難以復(fù)刻葉表皮結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié);氫氧化鈉離析法對(duì)時(shí)間的要求很高，效果僅次于撕取法;水楊酸甲酯透明法在透明不同樹種時(shí)效果差異較大。綜上所述，撕取法適合西府海棠類較易撕取葉表皮的植物，氫氧化鈉離析法適用于如垂絲海棠難以撕取葉表皮的植物，指甲油印跡法可以用于快速觀察植物氣孔形態(tài)，水楊酸甲酯透明法受材料限制嚴(yán)重，白膠印跡法不適用于葉表皮結(jié)構(gòu)觀察。

關(guān)鍵詞 葉表皮觀察;撕取法;印跡法;離析法;海棠

中圖分類號(hào) Q944.56? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2020）20-0127-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.034

Observation and Comparison of Crabapple Leaf Epidermis by Different Methods

CHEN Yi-ning， TAN Wen-wen， PENG Ye et al

（College of Biology and Environment， Nanjing Forestry University，Nanjing，Jiangsu 210037）

Abstract In order to compare the differences of epidermis structure of different crabapple varieties and select the best method of observation， we selected Malus micromalus， Malus hupehensis and Malus halliana， using direct peeling method， nail polish blotting method， white glue blotting method， NaOH isolation method and methyl salicylate（MeSA） clearing method to observe and compare the leaf epidermis of different crabapples. To compare different methods with direct peeling method to summarize their characteristics. The results showed that both epidermis structures of three crabapples were basically similar. Upper epidermis had wax pattern， and stomatal apparatus was irregular. The leaf structure of M. hupehensis was like that of M. halliana， and its epidermal cell data were not affected by the method. Direct peeling method had the best clarity. Nail polish blotting method was convenient to operate， but the epidermis cells were shrunken， and the results of different types of nail polish were different. It is difficult to reproduce the details of leaf epidermis by white glue blotting method. NaOH isolation method had high demands on time， and the final effect was similar to the direct peeling method. The transparency of MeSA clearing method was various in different tree species. In conclusion， direct peeling method is suitable for the plants which are easy to peel leaf epidermis such as M. micromalus. NaOH isolation method is suitable for plants like M. halliana， which are difficult to peel the leaf epidermis. Nail polish blotting method can be used to quickly observe the stomatal morphology of plants. MeSA clearing method is seriously restricted by materials. White glue blotting method is not suitable for the observation of leaf epidermis.

Key words Observation of leaf epidermis;Direct peeling method;Blotting method;Isolation method;Crabapple

近年來全球環(huán)境的不斷變化，高溫等極端天氣增多，隨之而來的干旱、強(qiáng)光照等情況都對(duì)城市綠化樹木的生存構(gòu)成威脅。海棠作為常見的觀賞樹種在我國應(yīng)用非常廣泛，道路、公園、小區(qū)、庭院等均有種植 [1-2]。探究其對(duì)惡劣環(huán)境的適應(yīng)性，有利于栽培管理。

葉片表皮結(jié)構(gòu)特征在植物適應(yīng)極端環(huán)境的研究中占有十分重要的地位。氣孔是葉片表皮結(jié)構(gòu)的重要組成，作為植物葉片與外界進(jìn)行氣體交換的主要通道，在植物光合作用、呼吸作用和蒸騰作用等方面具有非常重要的生理意義。氣孔面積、氣孔密度和氣孔指數(shù)等數(shù)據(jù)也常被用來作為衡量植物抗逆性的指標(biāo) [3]。

不同植物由于葉片性狀不同，適用的觀察方法也不同。目前，觀察植物葉表皮一般使用撕取法、刮制法、印跡法和離析法等方法 [3-5]。由于指甲油印跡法的操作簡單，因此使用頻率逐漸升高。試驗(yàn)使用3種性質(zhì)不同的指甲油分別制片觀察，對(duì)比其使用效果。

我國是海棠屬植物的分布中心 [6]，但是原生種的保存與利用長期不受重視;目前只有西府海棠（Malus micromalus）、湖北海棠（Malus hupehensis）、垂絲海棠（Malus halliana）等少數(shù)幾個(gè)種類有實(shí)際應(yīng)用 [7]。西府海棠和垂絲海棠是我國特有植物，作為觀賞植物已有很長的歷史 [8-10]。西府海棠主要分布在我國北方地區(qū)。湖北海棠除了具有觀賞價(jià)值外 [11]，還是重要的蘋果砧木 [12]，原產(chǎn)于湖北 [13]，主要分布在我國中部地區(qū) [14]。試驗(yàn)選取不同方法對(duì)這3種海棠葉表皮結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析，并對(duì)幾種方法特性進(jìn)行歸納，以期為后續(xù)海棠抗逆性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

西府海棠、湖北海棠、垂絲海棠葉片均采自南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 撕取法。

取新鮮海棠葉片，用鑷子直接撕取葉片上下表皮置于滴過清水的載玻片上，蓋上蓋玻片，敲除氣泡， 鏡檢。

1.2.2 指甲油印跡法。

選用名創(chuàng)油性指甲油06亮油（油性頂油）、悅詩風(fēng)吟生機(jī)指甲底油（油性底油）、名創(chuàng)一米陽光水性撕拉型指甲油01透明色（水性指甲油）對(duì)葉片表皮細(xì)胞進(jìn)行復(fù)刻。取新鮮的海棠葉片，在不同葉片的上下表面涂抹 6 cm2 透明指甲油（2次，每次半刷：甲油刷提起后在瓶口刮去一半）。待指甲油完全干燥后撕下制片，進(jìn)行觀察。

1.2.3 白膠印跡法。

取新鮮的海棠葉片，在葉片表面厚涂一層白膠[得力白膠（No.9070）]，剛好純白色不透明的厚度為宜。晾干后，制片觀察 [3]。

1.2.4 氫氧化鈉離析法。

取新鮮的西府海棠葉片，用刀片去除上端1/3和下端1/3，在中間1/3主脈兩側(cè)各切下1 cm× 1 cm 的葉片。將小葉片放入盛有70%FAA固定液的小瓶中進(jìn)行固定。試驗(yàn)當(dāng)天進(jìn)行70%、50%、30%乙醇的梯度復(fù)水。在純水中靜置后，將小葉片放入裝有3%氫氧化鈉的離心管中進(jìn)行水浴加熱解離20 min [15]。取出小葉片，刮去其上表皮和葉肉組織，制片觀察。

1.2.5 水楊酸甲酯透明法。

取“1.2.3”中同時(shí)固定的小葉片，用70%乙醇洗滌3次，每次30 min。隨后80%、85%、90%、95%、100%乙醇脫水，每梯度1 h，20 min換一次乙醇。乙醇∶水楊酸甲酯（3∶1、1∶1、1∶3）各濃度梯度過渡1 h后用純水楊酸甲酯浸泡至葉片可透光 [16-17]。

1.3 葉片表皮觀察與數(shù)據(jù)處理

在40倍物鏡下，每種樣品選取3個(gè)視野進(jìn)行觀察，每個(gè)視野選10個(gè)氣孔測(cè)量其直徑與寬度，10個(gè)表皮細(xì)胞測(cè)量其面積。

試驗(yàn)均使用尼康50i研究級(jí)顯微鏡觀察并拍照，使用Photoshop CS6進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量前處理，使用Image J（1.52a）進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量，使用SPSS 25進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種海棠葉表皮結(jié)構(gòu)特征

由圖1可知，3種海棠的上、下表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本相似，上表皮均具有蠟質(zhì)紋飾，細(xì)胞面積均大于下表皮。垂絲海棠與湖北海棠的上表皮細(xì)胞較西府海棠更大，并且更不規(guī)則，鑲嵌結(jié)構(gòu)更加明顯。

3種海棠的氣孔器均為不規(guī)則氣孔類型 [18-19]，由2個(gè)腎形的保衛(wèi)細(xì)胞和若干副衛(wèi)細(xì)胞組成;副衛(wèi)細(xì)胞與普通表皮細(xì)胞未有明顯不同，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞兩極有“T”型加厚。3種海棠的氣孔在葉片下表皮分布不均勻，不同位置氣孔密度不同（表1）。 湖北海棠的保衛(wèi)細(xì)胞中具有更多的內(nèi)含物。

方差分析結(jié)果表明，垂絲海棠和湖北海棠在葉片表皮結(jié)構(gòu)上具有更強(qiáng)的相似性。

2.2 不同制片方法獲得的顯微圖像比較

如圖2D、3D所示，在使用撕取法獲得的圖像中，氣孔和表皮細(xì)胞形態(tài)清晰可見，輪廓邊緣十分明朗，并且依稀可見胞內(nèi)內(nèi)含物。

指甲油印跡法得到的圖像在顯微鏡相稱模式下極具立體感。2種油性指甲油呈現(xiàn)的圖像（圖2A、2B）沒有顯著區(qū)別，均可提取清晰的上表皮細(xì)胞紋飾并較為精準(zhǔn)地復(fù)刻氣孔形態(tài)，但是無法呈現(xiàn)出清晰的細(xì)胞邊界，圖像中下表皮細(xì)胞難以辨認(rèn)（圖3A、3B）。使用水性指甲油得到的圖像（圖2C、3C），無論是上表皮還是下表皮都不夠清晰，存在邊緣線渙散和部分區(qū)域變形等問題。

白膠印跡法成膜效果非常好，干燥后易撕取。但由于各種原因無法完成聚焦得到較清晰的圖片，故在此未 展示。

水楊酸甲酯透明法試驗(yàn)中，只有湖北海棠葉片透明的效果較好（圖2E），轉(zhuǎn)換焦平面可依次觀察上表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞等。其余2種海棠使用這種透明方法均不成功。

氫氧化鈉離析法得到的圖像（圖3E）顏色不太干凈，部分葉肉組織難以去除對(duì)聚焦產(chǎn)生影響。整體效果與撕取法差

不多，可見較清晰的氣孔和表皮細(xì)胞形態(tài)及輪廓。

上述幾種制片方法除白膠印跡法外都可以清晰呈現(xiàn)出氣孔形態(tài)。撕取法的清晰度極高，可以提供表皮細(xì)胞和氣孔數(shù)據(jù)的無障礙測(cè)量。從表2、3中可以看出：氫氧化鈉離析法的清晰度僅次于撕取法，但制片時(shí)間較長;其測(cè)量數(shù)據(jù)與撕取法對(duì)比存在部分差異。指甲油印跡法的制片時(shí)間更短、定位性更高，但是其測(cè)量數(shù)據(jù)分析后與撕取法存在較大差異。

在此次試驗(yàn)中，湖北海棠的測(cè)量數(shù)據(jù)似乎受方法影響不大，推測(cè)與其葉表皮特性有關(guān)（表3）。

3 討論

3.1 撕取法

通過對(duì)試驗(yàn)過程和數(shù)據(jù)處理結(jié)果的綜合對(duì)比，撕取法在顯微測(cè)量方面展現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)。撕取法結(jié)合熟練刮除手法，可以得到較完整、近全透明的葉片上下表皮用于觀察氣孔和葉片表面其他形貌特征，清晰的圖像也使數(shù)據(jù)測(cè)量十分方便。同時(shí)，未經(jīng)過藥品處理的葉表皮所提供的形態(tài)和尺寸信息更接近真實(shí)，也更具有說服力。在需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行精準(zhǔn)測(cè)量的時(shí)候，建議使用撕取法。

3.2 印跡法

相比撕取法的“原件”，指甲油印跡法中用于

觀察的是“復(fù)刻件”。油性指甲油會(huì)使下表皮細(xì)胞皺縮，圖像失真十分嚴(yán)重;其中油性底油較頂油形成的油膜較脆，撕取時(shí)容易開裂;水性指甲油本身性質(zhì)柔軟，在撕取制片過程中容易變形。由于印跡法通過覆膜進(jìn)行表面信息提取，并通過油膜不同厚度的成像，“復(fù)刻件”圖像本身存在誤差;后期測(cè)量時(shí)，由于細(xì)胞的邊緣存在模糊，會(huì)使誤差更大。雖然不建議在需要精準(zhǔn)數(shù)據(jù)時(shí)使用指甲油印跡法，但是這種方法方便，在快速觀察氣孔形態(tài)和提取葉片表面紋飾方面還很優(yōu)秀，在3種指甲油中油性頂油的效果最好。

白膠溶于水，且溶解速度非常快，制片時(shí)會(huì)在極短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生渾濁。若用無水乙醇進(jìn)行制片，膠膜會(huì)收縮打卷，鏡檢效果不好，不能復(fù)刻出葉片表面的細(xì)節(jié)，不建議使用。

3.3 水楊酸甲酯透明法

用水楊酸甲酯對(duì)葉片進(jìn)行整體透明，成功時(shí)的圖像非常有趣。雖然清晰度比不上撕取法，但呈現(xiàn)出的細(xì)胞形態(tài)不錯(cuò)，基本會(huì)保持在植物細(xì)胞的生活狀態(tài);缺點(diǎn)是不是所有植物的葉片都可以順利被透明。

3.4 氫氧化鈉離析法

氫氧化鈉離析法的操作過程十分繁瑣，對(duì)受試樣品和操作者都有較高的要求。前期固定和復(fù)水的時(shí)間較長，樣品進(jìn)入氫氧化鈉水浴后，會(huì)出現(xiàn)發(fā)黑的情況：小葉片變得漆黑不透明，無法分清葉片上下表面;進(jìn)行指定面表皮提取的障礙非常大。經(jīng)離析后的葉片表皮不可以整張剝離，需要配合刮除手法清理葉肉細(xì)胞。出于時(shí)間考慮，不推薦使用。

4 結(jié)論

通過對(duì)5種方法的比較，撕取法制取的表皮區(qū)域是隨機(jī)的，定位性較差，但是具有清晰度高、真實(shí)性強(qiáng)等特點(diǎn)，可用于數(shù)據(jù)測(cè)量，適合西府海棠這樣葉脈較少、容易撕取葉片表皮的植物。氫氧化鈉離析法的定位性好，不受材料限制，雖然操作繁瑣，但適合像垂絲海棠這樣不易撕取葉表皮的葉片。水楊酸甲酯透明法的清晰度、定位性和真實(shí)度都十分可觀，但是受材料限制嚴(yán)重，具體使用條件還需要再繼續(xù)探索。指甲油印跡法中效果最好的是油性頂油，可用于快速觀察氣孔形態(tài);指甲油會(huì)使表皮細(xì)胞皺縮，雖然可能對(duì)湖北海棠類似葉片的影響不大，但仍然不建議用于數(shù)據(jù)測(cè)量。不推薦使用白膠印跡法。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分布相似的湖北海棠和垂絲海棠在葉表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)上明顯更具有相似性，而分布在較北方的西府海棠的葉表皮結(jié)構(gòu)與前兩者的差異較大，更小的氣孔密度也許意味著更強(qiáng)的抗逆性。選擇最合適的海棠葉表皮觀察方法得到精確的顯微結(jié)構(gòu)，對(duì)進(jìn)一步研究不同海棠的抗逆生理具有重要的輔助作用。同時(shí)，了解其葉片表皮結(jié)構(gòu)與環(huán)境的關(guān)系，有利于對(duì)不同品種海棠區(qū)別應(yīng)用，特別是作為城市綠化植物的栽培管理和蘋果嫁接砧木方面的選擇。

參考文獻(xiàn)

[1] 武春霞，楊靜慧，索何鳳，等.3種海棠葉片解剖結(jié)構(gòu)與抗旱性的關(guān)系[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，22（12）：11-14，27.

[2] 邢英麗，姜永峰，唐世勇，等.北方城市觀賞海棠品種及在園林綠化中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2010（2）：161-163.

[3] 楊芳，蒲訓(xùn).被子植物葉片氣孔制片方法研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（22）：33-34，37.

[4] 方純嬌，韓雪，史冬燕，等.牡丹葉片氣孔觀察方法的比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（13）：41-42，76.

[5] 葉春秀，莊振剛，李有忠，等.棉花葉片氣孔制片方法比較及改良[J].分子植物育種，2014，12（3）：543-546.

[6] 劉志強(qiáng)，湯庚國.南京地區(qū)垂絲海棠品種分類研究[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，28（1）：101-106.

[7] 唐菲，丁增成，任杰，等.我國觀賞海棠種類及品種概述[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（16）：190-195，218.

[8] 劉云鵬.寧南山區(qū)西府海棠栽培管理技術(shù)[J].寧夏農(nóng)林科技，2018，59（6）：24-25.

[9] 李艷輝.西府海棠在北方園林中的應(yīng)用[J].綠色科技，2018（17）：129-130.

[10] 曹穎，韓儀善.垂絲海棠栽培管理與觀賞應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備，2016（7）：153.

[11] 何秀娟，邱文明，徐育海.湖北海棠觀賞型新品系篩選研究[J].湖北林業(yè)科技，2014，43（4）：5-8.

[12] 邱文明，何秀娟，徐育海.矮化型湖北海棠種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與鑒定[J].中國南方果樹，2014，43（4）：104-106，110.

[13] 俞德浚.中國果樹分類學(xué)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1991.

[14] 陳琳琳，吳瑞姣，劉連芬，等.湖北海棠的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J].北方園藝，2013（16）：217-221.

[15] 溫壽星，郭祥桃，黃鏡浩，等.觀察柑橘葉片表皮細(xì)胞與氣孔結(jié)構(gòu)的簡易制片方法[J].東南園藝，2016，4（6）：21-23.

[16] 陳慶亮，翟志席，楊重軍，等.肉蓯蓉種子和胚的整體透明染色技術(shù)研究[J].中草藥，2005，36（10）：1559-1561.

[17] 李彥坤，臧鞏固，趙立寧，等.整體透明技術(shù)觀察懸鈴葉苧麻胚胎發(fā)育的方法研究[J].中國麻業(yè)科學(xué)，2011，33（3）：142-146.

[18] 楊芳，蒲訓(xùn).植物氣孔類型初步分類考證[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（22）：193-196.

[19] 金延明，李勝華，蔡少青.中藥材中常見氣孔類型與特征鑒別[J].中國中藥雜志，1994，19（5）：267-268.