安銀 戴星 羅海霞 熊孟連

【摘?? 要】 ：NAC轉錄因子作為植物最大的轉錄因子家族之一，當植物遭到逆境時，會通過一系列應激反應將調控信號逐級放大，促進 NAC轉錄因子與啟動子結合調控相關基因的表達，以增強細胞脅迫應答能力。

【關鍵詞】 青錢柳;CpMTF9;基因克隆;生物信息學分析

中圖分類號：[Q37]?????????????? 文獻識別碼：A?????????????? 文章編號：2096-1073（2020）11-0054-55

[Abstract] NAC transcription factors， as one of the largest transcription factor families in plants， amplify the regulatory signals step by step through a series of stress responses， and promote the expression of related genes by binding NAC transcription factors to promoters to enhance the ability of cell stress response.

[Key words]? Qingqianliu; CpMTF9; gene cloning; bioinformatics analysis

當植物遭到非生物脅迫之后，內質網內會累積大量錯誤折疊的蛋白質，從而影響植物的生長發(fā)育[1]。為了緩解惡劣環(huán)境對植物生長發(fā)育的影響，細胞會通過啟動信號轉導途徑調節(jié)相關基因的表達，去幫助錯誤的蛋白質折疊[2]。NAC家族是目前發(fā)現(xiàn)最大的特異性轉錄因子基因家族之一[3]。擬南芥NAC083，具有脫氧核糖核酸和蛋白結合活性[4]，可編碼一個NAC域轉錄因子。青錢柳（Cyclocarya Paliurus）是我國的瀕危樹種之一[5]。國內現(xiàn)階段對于青錢柳的研討重點主要是藥用價值、青錢柳苗木的快速繁殖技術等方面，關于NAC基因抗逆方面的報道很少。

本研究通過青錢柳轉錄組文庫的隨機克隆測序分析，獲得與NAC家族膜結合轉錄因子基因AtNAC083相似的一條cDNA序列（Cluster-29186.100002）。經預測分析，該基因為膜結合轉錄因子。對青錢柳CpMTF9進行生物信息學分析，分析結果有助于加深對青錢柳內質網脅迫途徑的認識。

1? 結果與分析

1.1? CpMTF9基因的克隆及其編碼蛋白質與Motif搜索

用植物總RNA提取試劑盒提取青錢柳葉片的總RNA，再用反轉錄試劑盒對青錢柳的cDNA進行合成;以青錢柳葉片cDNA為模板，設計引物對CpMTF9進行克隆，通過測序顯示成功得到含有一個完整開放閱讀框的長度為723bp的cDNA序列，共編碼形成240個氨基酸。利用在線工具ExPASy對CpMTF9的氨基酸序列展開理化屬性分析，結果表明該基因序列所翻譯蛋白質的分子量為26.86kD，等電點為9.65，蛋白質分子式為C1182H1824N340O355S12;在組成蛋白的20種氨基酸中，該蛋白半衰期為30h，CpMTF9蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為41.04，所以該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。利用PROSITE在線工具對蛋白進行Motif搜索，結果顯示該蛋白的Motif與其結構域分析結果一致，表明該蛋白具有NAC家族成員相關的序列模式（圖1）。

1.2?? CpMTF9結構分析

通過在線工具ExPASy對CpMTF9進行三級結構預測，預測結果表明，CpMTF9蛋白與擬南芥ANAC083蛋白的空間三級結構相似（圖2）。

2? 結果與討論

生物信息分析技術目前已經成為預測目的基因功能的基本方法，但由于只能通過預測來判斷基因的功能，因此要確定目的基因的功能就必須要對目的基因進行驗證。研究表明非生物脅迫會引發(fā)錯誤折疊的蛋白質富集在內質網中，導致青錢柳減產。為了滿足市場對青錢柳的需求，本研究成功從青錢柳中克隆得到一個NAC轉錄因子CpMTF9，該基因是NAC家族成員中膜結合轉錄因子相關基因。同源多序列比對顯示，CpMTF9基因與擬南芥ANAC083基因的序列、功能都具有很高的相似性。因此，推測CpMTF9基因在緩解惡劣環(huán)境對植物生長發(fā)育的影響方面有著重要的作用。這對于未來研究CpMTF9基因在青錢柳內質網脅迫信號途徑中的作用具有重要意義。

3? 實驗方法

使用反轉錄試劑盒，依次加入RNA，Oligo-dT，dNTP，DTT，M-MLV反轉錄酶和ddH2O后將RNA反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板，使用PFU-KOD高保真酶進行目的基因的PCR擴增。將得到的CpMTF9目的片段及PGBKT-7載體同時用BamH Ⅰ及ECOR I在37℃下進行雙酶切。酶切回收的產物用連接酶進行16℃過夜酶連。將過夜連接的產物全部轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，并涂布于Kan+抗性培養(yǎng)基上、倒置在37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑單克隆進行陽性鑒定后提取質粒，并送到公司進行測序。

參考文獻：

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[5] 鄒榮燦，吳少錦.青錢柳的分布、化學成分及藥理作用研究進展[J].中國藥房， 2017，28（31）：4449-4451.

（編輯：赫亮）