楊歡，彭雨蒙，李輝龍，韋猛，陳智煒，唐置鴻，孟維達(dá)，韋滔，魏從文，鐘輝，吳飛翔，3，4

1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽外科，廣西 南寧 5300021；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100850；3.廣西肝癌診療工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530021；4.區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例和死亡病例均超過80萬例[1-2]。目前，中晚期肝癌患者以局部治療、系統(tǒng)治療等為主[3]。目前各種常見治療手段都有局限性，所以現(xiàn)在肝癌治療領(lǐng)域的共識是多學(xué)科協(xié)作和多種治療方法聯(lián)用的綜合治療[4]。綜合治療方法包括介入治療、消融治療、靶向治療、免疫治療和放化療等，由于分子靶向治療的選擇性、靈敏性和效率都很高，靶向治療以成為傳統(tǒng)肝癌治療手段之外極其重要的治療方法[5]。作為第一個(gè)被美國FDA批準(zhǔn)用于治療肝癌的分子靶向治療藥物，索拉菲尼是肝癌系統(tǒng)性治療中惟一能夠改善患者存活率、顯著延長晚期患者總體生存時(shí)間的化療藥物。

索拉菲尼是一種新型多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物，通過與細(xì)胞內(nèi)ATP結(jié)合位點(diǎn)上的三磷酸腺苷競爭性結(jié)合，阻斷酪氨酸激酶和絲/蘇氨酸激酶的活性。大量臨床研究表明，絕大部分HCC患者通過一段時(shí)間的索拉菲尼藥物治療后，表現(xiàn)出明顯的藥物耐受特征，導(dǎo)致索拉菲尼對HCC的療效欠佳。多種機(jī)制與索拉菲尼的獲得性耐藥相關(guān)，有報(bào)道顯示腫瘤細(xì)胞SIRT1、EGFR或其配體等分子的過表達(dá)，PI3K/Akt、JAK/STAT3信號通路的異常激活，以及Ras/Raf/MEK/ERK通路的活性下調(diào)均降低HCC對索拉菲尼的敏感性[6-7]。

高爾基蛋白73（Golgi protein 73，GP73）又名GOLM1（Golgimembraneprotein1）或 GOLPH2（Golgi phosphorprotein 2），是2000年發(fā)現(xiàn)的一種高爾基膜蛋白，在正常肝臟的膽管上皮細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)[8]。70%以上的肝癌病人，GP73蛋白在血清及肝組織中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)。最近的研究已證實(shí)GP73在肝癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的重要作用，張宏冰等研究發(fā)現(xiàn)mTORC1能夠通過調(diào)節(jié)GP73促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展[9]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的GP73抑制了由饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的激活，而GP73敲除細(xì)胞的自噬水平明顯升高。自噬在肝癌索拉菲尼的原發(fā)性耐藥中具有雙向作用。mTOR抑制劑雷帕霉素（rapamycin）并不能完全恢復(fù)耐藥細(xì)胞株對索拉菲尼的敏感性。這就提示我們，在索拉菲尼獲得性耐藥的HCC細(xì)胞中還有別的機(jī)制參與自噬的負(fù)調(diào)控。因此，研究GP73與索拉菲尼獲得性耐藥的關(guān)系對原發(fā)性肝癌的分子靶向治療具有重要意義。

在本研究中，我們探討了GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)情況，以及GP73對索拉菲尼耐藥性的影響，為GP73參與肝癌索拉菲尼獲得性耐藥的分子機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞HepG2（本實(shí)驗(yàn)室保存）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；索拉菲尼（Sigma-Aldrih公司）；轉(zhuǎn)染試劑VigoFect（Qbiogene公司）；MTT檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；Flag-GP73、Flag-Vector（本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）；si-GP73、si-scramble（吉瑪基因公司）；anti-GP73抗體、anti-Tubulin抗體（Abcam公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，構(gòu)建耐藥細(xì)胞株時(shí)，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的索拉菲尼。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 h更換一半新鮮的DMEM培養(yǎng)基，按說明書要求配制小干擾RNA（siRNA）和轉(zhuǎn)染試劑混合液，滴加入細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h后補(bǔ)充另一半培養(yǎng)基。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率

細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的D490nm值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞，1×PBS沖洗3次，3000 r/min離心3 min后棄上清。加入適量1×PBS重懸細(xì)胞，加入等量4×SDS緩沖液［10%甘油，2%十二烷基苯磺酸鈉，50 mmol/L Tris-HCl（pH6.8），2.5% β巰基乙醇，0.1%溴酚藍(lán)］，沸水浴15 min，12 000 r/min低溫離心10 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE，半干轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶液室溫封閉1 h，一抗和二抗分別室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，將Perkin Elmer的ECL發(fā)光液均勻涂在PVDF膜上，暗室顯影。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

采用Graphpad prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)量資料采用x±s表示，組間比較采用雙因素方差分析；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HepG2細(xì)胞索拉菲尼耐藥株的構(gòu)建

在HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中加入索拉菲尼，使其終濃度為0.5 μmol/L，連續(xù)作用1周；換成新鮮培養(yǎng)基，鏡下觀察細(xì)胞正常生長后，增加0.25 μmol/L溶液繼續(xù)培養(yǎng)1周。如此反復(fù)換液、傳代，逐步提高索拉菲尼濃度（0.5～5 μmol/L）間歇誘導(dǎo)，最終獲得HepG2細(xì)胞的索拉菲尼耐藥株（HepG2-SR）。為了驗(yàn)證構(gòu)建的索拉菲尼耐藥細(xì)胞株對索拉菲尼的敏感性降低，在野生型HepG2細(xì)胞及索拉菲尼獲得性耐藥細(xì)胞株中加入不同濃度的索拉菲尼，MTT法檢測細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中索拉菲尼濃度越高，細(xì)胞存活率越低；索拉菲尼耐藥細(xì)胞株對索拉菲尼的敏感性比野生型細(xì)胞大幅降低（P＜0.05）（圖1）。HepG2索拉菲尼耐藥細(xì)胞株建立成功。

2.2 GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)明顯升高

收集野生型HepG2細(xì)胞和HepG2索拉菲尼耐藥株細(xì)胞，分別加入等量的PBS和4×SDS緩沖液重懸，沸水浴15 min使細(xì)胞充分裂解。12 000 r/min低溫離心10 min，取等量上清進(jìn)行SDSPAGE。半干轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶液室溫封閉 1 h，anti-GP73抗體（1∶1000 TBST溶解）、anti-Tubulin抗體（1∶5000 TBST溶解）室溫?fù)u床孵育1 h，用5%脫脂奶粉以1∶2000的比例稀釋羊抗鼠HRP-conjugated二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗3次，以1∶1的比例配制ECL發(fā)光液顯影。結(jié)果顯示，GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)比野生型細(xì)胞株高（圖2）。

2.3 過表達(dá)GP73的HepG2細(xì)胞對索拉菲尼敏感性降低

GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞株中高表達(dá)，接下來將GP73在野生型HepG2細(xì)胞中高表達(dá)，研究GP73在肝癌細(xì)胞中對索拉菲尼敏感性的影響。在野生型HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-GP73，對照組轉(zhuǎn)染等量Flag-Vector，24 h后加入不同濃度的索拉菲尼（0、5、10、15、20 μmol/L）處理細(xì)胞，48 h后收取細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞存活。結(jié)果表明，隨著索拉菲尼的濃度升高，細(xì)胞存活率明顯越低；而過表達(dá)GP73的HepG2細(xì)胞（Flag-GP73）對索拉菲尼的敏感性較對照組（Flag-Vector）降低（P＜0.05）（圖 3）。

2.4 耐藥細(xì)胞株敲低GP73能夠升高索拉菲尼的敏感性

GP73過表達(dá)后細(xì)胞對索拉菲尼的敏感性降低，接下來探討在肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞株中敲低GP73后對索拉菲尼敏感性的影響。在已構(gòu)建的索拉菲尼耐藥細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染si-GP73敲低細(xì)胞中的GP73水平，對照組轉(zhuǎn)染等量的si-scramble。24 h后加入不同濃度的索拉菲尼（0、5、10、15、20 μmol/L）處理細(xì)胞，48 h后收取細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞存活。結(jié)果表明，隨著索拉菲尼的濃度升高，細(xì)胞存活率明顯越低；而在索拉菲尼耐藥細(xì)胞中敲低GP73后，耐藥細(xì)胞株（si-GP73）對索拉菲尼的敏感性高于對照組（si-scramble）（P＜0.05）（圖4），表明耐藥細(xì)胞株敲低GP73能夠升高索拉菲尼的敏感性。

3 討論

圖1 索拉菲尼耐藥細(xì)胞株對索拉非尼的敏感性降低

圖2 GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞株中高表達(dá)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌作為發(fā)病率和病死率極高的癌癥之一，一直都是科研人員及臨床工作者努力攻克的難題。肝癌具有生長速度快、惡性程度高、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及藥物耐受等特點(diǎn)，因此肝癌患者的預(yù)后較差[10]。索拉菲尼作為多靶點(diǎn)的分子藥物，在肝癌治療中能夠改善患者存活率，但其療效仍然有限，耐藥性的產(chǎn)生可能是導(dǎo)致其化療失敗的主要原因[11]。因此，研究肝細(xì)胞癌的耐藥機(jī)制，對于提高其化療療效，指導(dǎo)臨床用藥有著重要的價(jià)值。

GP73不僅可以作為肝癌的腫瘤標(biāo)志物，也參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過程[12]。我們研究發(fā)現(xiàn)，在索拉菲尼獲得性耐藥的肝癌細(xì)胞株中，位于高爾基體的糖蛋白GP73的表達(dá)水平顯著升高。此外，GP73過表達(dá)細(xì)胞對索拉菲尼的敏感性降低，GP73敲低恢復(fù)了耐藥細(xì)胞對索拉菲尼的敏感性。因此，GP73很可能參與到原發(fā)性肝癌索拉菲尼耐藥的機(jī)制當(dāng)中。

圖3 GP73過表達(dá)細(xì)胞對索拉菲尼的敏感性降低

圖4 敲低GP73能升高索拉菲尼耐藥細(xì)胞株對索拉菲尼的敏感性

此前有研究發(fā)現(xiàn)自噬與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[13]。Shimizu等發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼可以激活HCC細(xì)胞的自噬，誘導(dǎo)自噬小體的形成，增強(qiáng)自噬的活性；而將自噬抑制劑與索拉菲尼聯(lián)用后，細(xì)胞凋亡增多，生存力下降，腫瘤生長受到明顯抑制。然而，Bareford等用索拉菲尼與自噬誘導(dǎo)劑培美曲塞聯(lián)合加入HCC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)培美曲塞與索拉菲尼可起協(xié)同作用[14]?？梢?，自噬在肝癌索拉菲尼的原發(fā)性耐藥中具有雙向作用。早前我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的GP73抑制了由饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的激活，而GP73敲除細(xì)胞的自噬水平明顯升高。因而，GP73很可能通過負(fù)調(diào)控自噬，進(jìn)而影響肝癌索拉菲尼獲得性耐藥。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)GP73在肝癌索拉菲尼獲得性耐藥的過程中有重要作用，為深入研究索拉菲尼耐藥的分子機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。