莊利萍，何偉，原慶會(huì)，郭君，周濤，胡佐鴻，楊倩

1.都江堰市中醫(yī)醫(yī)院 a.病理科，b.脾胃病科，四川 都江堰 611830；2.綿陽(yáng)市中心醫(yī)院 a.疼痛科，b.病理科，四川 綿陽(yáng) 621000；3.深圳市龍崗區(qū)第三人民醫(yī)院 病理科，廣東 深圳 518116；4.成都市第一人民醫(yī)院 病理科，四川 成都 610041；5.昆明市第一人民醫(yī)院 病理科，云南 昆明 650000

宮頸癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率逐年上升，且越來(lái)越趨于年輕化，嚴(yán)重影響女性患者的生命健康[1-2]。臨床已證實(shí)人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是誘發(fā)宮頸癌的重要原因[3]，但并非惟一因素。隨著當(dāng)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，分子靶向治療宮頸癌已成為研究熱點(diǎn)，但其治療機(jī)制尚未完全闡明。叉頭框蛋白 A1（forkhead box protein A1，F(xiàn)OXA1）是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員，被認(rèn)為能通過(guò)結(jié)合核小體DNA進(jìn)行基因調(diào)控[4]。多數(shù)研究[5-6]發(fā)現(xiàn)FOXA1在多種腫瘤中均有異常表達(dá)，如乳腺癌與食管癌，但其對(duì)宮頸癌遷移、侵襲的影響少見(jiàn)報(bào)道。在此，我們擬探討FOXA1在宮頸鱗癌中的表達(dá)情況及FOXA1低表達(dá)對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響，以期為宮頸癌的靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2014年10月至2019年10月于都江堰市中醫(yī)醫(yī)院和綿陽(yáng)市中心醫(yī)院行手術(shù)治療后經(jīng)病理科確診為浸潤(rùn)性宮頸鱗癌和宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者的石蠟組織標(biāo)本114例，其中CINⅠ-Ⅱ級(jí)34例、CINⅢ級(jí)20例、宮頸癌標(biāo)本60例。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在免疫相關(guān)合并癥；合并其他惡性腫瘤；存在宮頸放化療或其他相關(guān)治療。另收集因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)的正常宮頸組織40例作為對(duì)照組。所有標(biāo)本均確診并經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水包埋，4 μm連續(xù)切片，免疫組化染色。

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa（武漢博士德生物工程有限公司）；DMEM、胎牛血清、DMSO、青鏈霉素（Gibco公司）；SABC-AP免疫組化試劑盒（北京東升科技有限公司）；FOXA1兔抗人單克隆抗體（Abcam公司）；DAB顯色劑、二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；LipofectAMINE2000、MMP-9兔抗人單克隆抗體（Epitomics公司）；Transwell小室（Millipore公司）。平推切片機(jī)（LEICA公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo electron公司）；高速低溫離心機(jī)（Eppendorf公司）；PCR擴(kuò)增儀（Life Technologies公司）。

1.2 免疫組織化學(xué)EnVision法

將石蠟組織連續(xù)切片，于65℃恒溫箱中烤蠟30 min，二甲苯脫蠟后脫水，用3.0%過(guò)氧化氫室溫孵育 30 min，0.01 mol/L TBS（pH7.4）沖洗 2 min×3次；將切片置于加熱的枸櫞酸鹽緩沖液中，關(guān)閉鍋蓋并加熱至噴氣，計(jì)時(shí)2 min，隨后自然冷卻，0.01 mol/L TBS（pH7.4）沖洗2 min×3次；擦凈組織周圍水分，滴加一抗50 μL（稀釋濃度1∶300），4℃冰箱過(guò)夜；復(fù)溫，TBS洗去一抗，2 min×3次；滴加二抗PV-6000，37℃溫箱孵育20 min；TBS沖洗，2 min×3次；擦凈組織周圍水分后DAB顯色、復(fù)染、脫水、二甲苯透明，封片。結(jié)果判定[7]：①無(wú)色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，褐/黑色3分；②陽(yáng)性細(xì)胞占比≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。2種積分乘積＜3分記為“-”，3～5分記為“+”，6～9分記為“++”，＞9分記為“+++”。

1.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

HeLa細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HeLa細(xì)胞分為3組，即空白對(duì)照組、干擾組和陰性對(duì)照組。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將靶向FOXA1的siRNA（50 nmol/L）轉(zhuǎn)染干擾組HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒（50 nmol/L）作為陰性對(duì)照組，空白對(duì)照組正常培養(yǎng)細(xì)胞。分別于轉(zhuǎn)染后72 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞FOXA1、MMP-9 mRNA的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后72 h收集各組細(xì)胞，每孔加入1 mL TRIzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參，RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中FOXA1、MMP-9 mRNA的表達(dá)（反應(yīng)條件：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)）。FOXA1正義引物為5'-ATACTCCATGGAGATTGG-3'，反義引物為 5'-TCACCGCTCGAAGCTGGTA-3'；MMP-9正義引物為5'-ATGCGTGGAGAGTCGAAATC-3'，反義引物為 5'-CAAGGCGTCGTCAATCAC-3'；βactin正義引物為5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，反義引物為5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGA AGCA-3'。按公式 2-ΔΔCt計(jì)算 FOXA1、MMP-9 的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞中FOXA1、MMP-9蛋白的表達(dá)

收集各組細(xì)胞，每孔加入150 μL細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)濃度。每孔取30 μg蛋白行12% SDS-PAGE，后于4℃、2 mA/cm2穩(wěn)流轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，用稀釋的 FOXA1、MMP-9一抗（1∶2000）于4℃孵育過(guò)夜，隨后洗掉一抗，用二抗PV-6000室溫孵育1 h，TBST清洗5 min×3次，ECL發(fā)光法顯影，應(yīng)用Quantity One 4.6.2檢測(cè)灰度值，計(jì)算FOXA1、MMP-9蛋白的表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力

轉(zhuǎn)染后72 h收集各組細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，采用10 μL槍頭比著直尺，垂直于培養(yǎng)板劃痕，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入DMEM，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下觀察各組細(xì)胞劃痕愈合情況，以劃痕兩側(cè)細(xì)胞的距離為劃痕寬度。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力

將 200 μL濃度為 1×109/L的 HeLa細(xì)胞懸液加入鋪有基質(zhì)膠的小室上層，下室加入600 μL含胎牛血清的DMEM，于37℃孵箱中孵育24 h，用無(wú)菌棉簽輕拭小室內(nèi)細(xì)胞，擦拭干凈后用結(jié)晶紫染色10 min，鏡下觀察并拍照計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均以x±s，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組標(biāo)本中FOXA1的表達(dá)情況

免疫組化染色中，F(xiàn)OXA1陽(yáng)性表達(dá)定位于胞漿和胞核內(nèi)，主要以胞漿內(nèi)為主（圖1）。FOXA1在宮頸鱗癌中的染色陽(yáng)性率明顯高于CIN各級(jí)組織及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=120.346，P＜0.05）；CINⅠ-Ⅱ、CINⅢ中的染色陽(yáng)性率與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.574，P＞0.05）（表1）。

圖1 FOXA1在宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變及正常宮頸組織中的表達(dá)（×200）

2.2 各組細(xì)胞中FOXA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，干擾組FOXA1 mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.344，P＜0.05）（圖2）。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，干擾組FOXA1蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=207.074，P＜0.05）（圖3）。提示FOXA1 siRNA轉(zhuǎn)染成功。

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，干擾組細(xì)胞的遷移愈合距離明顯較空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組增寬，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=120.901，P＜0.05）。

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力

表1 FOXA1在CINⅠ-Ⅱ、CINⅢ、宮頸癌及正常宮頸組織中的表達(dá)情況

圖2 各組細(xì)胞中FOXA1 mRNA表達(dá)水平比較

圖3 各組細(xì)胞中FOXA1蛋白表達(dá)水平比較

侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5，干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.952，P＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)水平

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，干擾組MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5477.500、377.625，P＜0.05）（圖6）。

3 討論

宮頸癌的發(fā)生與多因素、多基因、多步驟有關(guān)，HPV感染、多次人工流產(chǎn)、過(guò)早頻繁的性生活等均是促進(jìn)宮頸癌發(fā)生的相關(guān)因素[7]。宮頸癌的常規(guī)治療包括手術(shù)加放/化療，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，涌現(xiàn)了眾多宮頸癌臨床治療方法，但至今未達(dá)到預(yù)期的治療效果[8]。長(zhǎng)期的臨床隨訪研究[9]顯示，宮頸癌患者治療后5年內(nèi)的生存率不足35%，中位生存時(shí)間、病死率等預(yù)后指標(biāo)均未得到明顯改善，晚期患者預(yù)后仍較差。因此，尋找輔助宮頸癌篩查的生物標(biāo)志物，可為宮頸癌高危人群提供潛在的治療和篩查靶點(diǎn)。

FOX蛋白是一個(gè)大家族，根據(jù)叉頭結(jié)構(gòu)域保守的氨基酸序列，可以分為a～q共17個(gè)亞群，均與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、周期調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、分化、長(zhǎng)壽等多種生物學(xué)過(guò)程有關(guān)。FOX蛋白家族的基因突變和表達(dá)異?？赡軙?huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)發(fā)育異常、代謝性疾病和腫瘤[10-11]。FOXA1是FOXA亞家族的成員，在人體肺部、乳腺、肝臟、膀胱等組織中可見(jiàn)表達(dá)，能與百余個(gè)基因的啟動(dòng)子相結(jié)合，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等作用[12]。在本研究中，我們分析了FOXA1在宮頸癌中的表達(dá)及對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響。首先，我們檢測(cè)了FOXA1在宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變及正常宮頸組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中FOXA1的染色陽(yáng)性率明顯高于宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變及正常宮頸組織，提示FOXA1在宮頸癌中呈高表達(dá)狀態(tài)。因此，我們用FOXA1 siRNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，以減少FOXA1的表達(dá)。結(jié)果表明，干擾組FOXA1 mRNA和蛋白水平較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均降低，提示FOXA1 siRNA轉(zhuǎn)染成功。進(jìn)一步對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)干擾組細(xì)胞的遷移和侵襲能力均較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯降低，提示降低FOXA1的表達(dá)能明顯抑制HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖4 各組細(xì)胞24 h后劃痕愈合情況

圖5 各組細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（×200）

圖6 各組細(xì)胞MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族一員，可參與多種病理生理過(guò)程[13]。相關(guān)研究[14]證實(shí)，MMP-9能與細(xì)胞表面的黏附分子結(jié)合，并通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅳ型膠原蛋白酶來(lái)破壞細(xì)胞血管基底膜及其外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤血管生成及腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，MMP-9在大多數(shù)惡性腫瘤組織中高表達(dá)，如胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌，MMP-9在癌組織中的表達(dá)均要高于癌旁組織。本研究發(fā)現(xiàn)，在FOXA1被抑制的HeLa細(xì)胞中，MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，提示FOXA1的低表達(dá)可能抑制MMP-9的表達(dá)，從而削弱HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，本研究表明FOXA1在宮頸癌中呈高表達(dá)狀態(tài)，靶向FOXA1的siRNA可明顯抑制FOXA1的表達(dá)，從而削弱HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，本研究首次證明靶向FOXA1可以降低MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)，從而抑制HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲，但其相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。