楊雪君，王森，潘婕，徐志曄

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 檢驗科，江蘇 南京 210008

原發(fā)性干燥綜合征（primary Sjogren's syndrome，pSS）是一種主要累及外分泌腺的慢性炎癥性自身免疫病[1]，多發(fā)于老年人群，女性多見，男女比例約為1∶9～1∶20。pSS的病因及發(fā)病機制有多種理論，可能與遺傳因素及免疫細胞功能異常相關(guān)，但具體的機制仍未完全明確[2-4]。pSS患者體內(nèi)多種免疫細胞功能異常導(dǎo)致一些細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-17等異常表達，這些細胞因子的異常表達及調(diào)節(jié)紊亂在干燥綜合征的發(fā)病和進展中具有重要作用[5]。高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein，HDL）可以逆向轉(zhuǎn)運膽固醇，具有抗動脈粥樣硬化的作用，以往的研究多集中于HDL在動脈粥樣硬化進展中的效力，但近年來的研究表明HDL還具有重要的免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用[6-9]。HDL在自身免疫性疾病特別是pSS中的表達水平及與炎癥的關(guān)系尚未見明確報道。在此，我們將回顧性分析HDL在pSS患者血清中的表達水平，并通過相關(guān)實驗研究其與炎癥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2019年1～12月在我院風(fēng)濕免疫科住院的350例pSS患者的臨床數(shù)據(jù)，其中男性28例，女性322例，平均年齡52.7歲，pSS的診斷符合2016年美國歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟制定的分類診斷標準[10]。對照組為健康體檢者共350例，男性30例，女性320例，平均年齡51.6歲?；颊呓M與健康對照組性別年齡間無統(tǒng)計學(xué)差異。另外收集30例干燥綜合征患者及30例年齡性別匹配的健康體檢者外周血血清，以檢測血清中的細胞因子水平及HDL水平。

1.2 材料

HDL及低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）（ProSpec公司）；脂多糖（LPS）（Sigma公司）；淋巴細胞分離液（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；RPIM1640細胞培養(yǎng)液（Thermo Fisher公司）；TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒（BD公司）；酶標儀（Bio-Rad公司）；臨床生化指標檢測全自動生化儀（Beckman公司）。

1.3 標本收集及檢測

30例pSS患者與30例健康對照分別空腹抽取5 mL靜脈血于含有分離膠和促凝劑的采血管，離心后取上清置于-80℃凍存，待標本收集完成后統(tǒng)一檢測HDL及細胞因子水平。

1.4 外周血單個核細胞（PBMC）的分離及培養(yǎng)

收集正常人新鮮外周血5 mL于EDTA抗凝管中，2000 r/min離心10 min，吸出上層血漿，剩余細胞加入等體積的PBS，混勻；準備2支15 mL的離心管，每管加入3 mL Ficoll，將混勻的細胞沿傾斜的管壁緩慢加入離心管中，配平后用水平轉(zhuǎn)子2300 r/min離心20 min，并設(shè)置離心機降速為最低；取出離心好的細胞，小心吸出血漿層與紅細胞層之間的細胞，加入5 mL PBS，1500 r/min離心5 min，去除上清后再次用PBS洗滌1次，棄上清，振蕩混勻細胞后加入2 mL RPMI1640培養(yǎng)液，重懸細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，鋪于24孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。

1.5 ELISA檢測細胞因子水平

配置含NaHCO3及Na2CO3的包被緩沖液，每個樣本用雙復(fù)空檢測，計算所需孔數(shù)，用包被緩沖液按1∶250的比例稀釋TNF-α及IL-6的包被抗體，按每孔100 μL加入新的包被板中，4℃孵育過夜；棄去包被液，每孔加入300 μL PBST洗滌3次，徹底去除孔中殘留液體；每孔加入200 μL含10%胎牛血清（FBS）的PBS液，室溫封閉1 h；按說明書要求稀釋標準品，并將樣本取出稀釋至1/2；每孔加入100 μL樣本、標準品或陰性對照；封板紙封閉板條，室溫孵育2 h；用樣本稀釋液按1∶250的比例稀釋二抗及辣根過氧化物酶（HRP）；棄去板孔中的樣本及標準品后用PBST洗滌板條5次，最后一次徹底去除板中殘留液體；每孔加入100 μL二抗及HRP混合液，封板并室溫孵育1 h；去除板中液體，再次用PBST洗滌5次；每孔加入100 μL顯色液，室溫避光孵育15 min，觀察顯色情況；每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)；放入酶標儀，讀取D450nm值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料用x±s表示，患者組與對照組之間差異比較用Student'st檢驗。當P＜0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，圖中用“*”標示，P＜0.01圖中用“**”標示。各指標的相關(guān)性研究采用Pearson相關(guān)性分析，統(tǒng)計學(xué)分析及做圖用GraphPad Prism 5軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 pSS患者組與健康對照組血脂水平的比較

分析了pSS患者組及健康對照組之間血清中血脂指標的差異。如表1所示，pSS患者組HDL、LDL、ApoAI及膽固醇水平均顯著低于健康對照組（P＜0.0001），而載脂蛋白B（ApoB）及甘油三酯在2組間無明顯差異。

2.2 pSS患者血清HDL水平與炎癥免疫指標的相關(guān)性分析

分析了患者血清中HDL的水平與炎癥指標［紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）］及免疫指標（IgG、IgA、IgM、IgE）之間的相關(guān)性。如表2所示，HDL水平與 ESR（r=-0.38，P＜0.0001）及IgG（r=-0.35，P＜0.0001）之間有顯著的相關(guān)性，而LDL水平與各炎癥指標及免疫指標均無明顯的相關(guān)性（表3）。

表1 pSS患者與健康對照者血脂水平比較

表2 pSS患者血清HDL水平與炎癥免疫指標相關(guān)性分析

表3 pSS患者血清LDL水平與炎癥免疫指標相關(guān)性分析

2.3 pSS患者血清HDL水平與炎癥細胞因子間的相關(guān)性分析

為了進一步研究pSS患者血清HDL水平與炎癥間的相關(guān)性，收集了30例pSS患者及30健康對照者血清，檢測血清中細胞因子IL-6及TNF-α的水平。如圖1A、C，pSS患者組的IL-6及TNF-α水平顯著高于對照組。分析pSS患者血清HDL水平及與細胞因子的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，HDL水平與IL-6及TNF-α的水平呈顯著的負相關(guān)（圖1B、D）。

2.4 HDL抑制PBMC中炎性細胞因子的產(chǎn)生

以上研究表明pSS患者血清HDL含量降低，并且HDL含量與炎癥指標及炎性細胞因子呈負相關(guān)。為了進一步證明HDL的抗炎作用，用純化的HDL及LDL預(yù)處理正常人PBMC 24 h，用LPS刺激細胞24 h，收集細胞培養(yǎng)上清，檢測TNF-α及IL-6的水平，發(fā)現(xiàn)HDL能以劑量依賴方式抑制TNF-α及IL-6的產(chǎn)生，而LDL無抑制作用（圖2）。

3 討論

pSS是一種慢性炎癥性的自身免疫性疾病，主要侵犯淚腺、唾液腺等外分泌腺，全身其他臟器也可受累。pSS患者血清中可檢測到多種自身抗體，同時患者外周血及受累器官局部炎性細胞因子水平也顯著升高。HDL因具有逆向轉(zhuǎn)運膽固醇的作用，所以在心血管疾病中具有保護作用，以往的研究關(guān)注HDL在心血管疾病中的作用，近年研究發(fā)現(xiàn)HDL具有抗炎作用，但在具體的疾病中HDL是否具有抗炎作用仍鮮有報道。本項研究發(fā)現(xiàn)pSS患者血清中的HDL水平顯著低于健康對照，并且pSS患者的HDL水平與ESR、IgG呈顯著負相關(guān)，與患者血清中細胞因子TNF-α、IL-6也具有顯著的負相關(guān)。表明pSS患者血清中HDL降低，并且與pSS患者的炎癥水平相關(guān)。

圖1 pSS患者血清HDL水平與細胞因子間的相關(guān)性分析

圖2 HDL抑制PBMC中細胞因子的產(chǎn)生

本研究檢測了pSS患者組及正常對照組間各血脂指標的含量，其中pSS患者組HDL、LDL、ApoAI、膽固醇的含量都顯著低于健康對照組。ESR和CRP是常見的反映自身免疫病活動性及炎癥水平的指標，IgG在干燥綜合征患者中普遍升高并與活動性相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)HDL與ESR及IgG具有顯著負相關(guān)，表明HDL可能與pSS患者的炎癥及活動性相關(guān)。ESR和CRP均是非特異性的炎癥指標，為了進一步探討HDL與炎癥的相關(guān)性，我們還檢測了常見的炎性細胞因子水平，發(fā)現(xiàn)pSS患者血清中TNF-α及IL-6水平顯著高于健康對照，并且HDL與TNF-α及IL-6呈顯著的負相關(guān)，進一步表明在pSS患者中，HDL可能起到對抗炎癥的作用。

HDL除具有抗氧化、逆向轉(zhuǎn)運膽固醇的作用外，還具有抑制炎癥的作用。Lee等的研究表明HDL可通過使小窩蛋白caveolin-1重新分布，從而抑制巨噬細胞向促炎性M1型巨噬細胞分化，進而抑制ERK1/2及STAT3的激活并抑制TNF-α、IL-6和MCP-1等炎性細胞因子的產(chǎn)生[11]。De Nardo等的研究表明HDL及ApoAI可以顯著抑制Toll樣受體（TLR）介導(dǎo)的細胞因子產(chǎn)生，進一步的機制研究表明HDL是通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子ATF3的表達進而抑制TLR介導(dǎo)的信號通路[12]。另有研究表明重組HDL可在樹突狀細胞（DC）中抑制PHA 誘導(dǎo)的 IL-6、IL-1β、IFN-α等細胞因子及CCL-2、CCL-4等趨化因子的產(chǎn)生，HDL也可顯著抑制TLR-2及TLR-4介導(dǎo)的DC的成熟[13]。這些研究表明HDL可抑制多種免疫細胞的激活，對天然免疫及適應(yīng)性免疫都具有調(diào)節(jié)作用。在自身免疫性疾病中，有研究檢測了血清HDL水平降低，并認為這和自身免疫性疾病患者易發(fā)心血管疾病相關(guān)[14-15]。但HDL含量與患者炎癥水平之間的關(guān)系尚未見明確報道。本項研究表明干燥綜合征患者血清中HDL含量降低，并與炎癥水平負相關(guān)，細胞學(xué)實驗證明重組HDL可抑制炎性細胞因子的產(chǎn)生，表明在干燥綜合征中HDL同樣發(fā)揮著對抗炎癥的作用。pSS患者體內(nèi)HDL水平降低的機制目前并不明確，有研究認為自身免疫性疾病患者體內(nèi)可能存在抗HDL及抗ApoAI的自身抗體，而這些因素導(dǎo)致的HDL含量降低影響并阻礙HDL抗炎作用的有效發(fā)揮，這可能進一步又引起了患者體內(nèi)出現(xiàn)過度炎癥。

綜上所述，本研究表明pSS患者血清中HDL、LDL的表達顯著低于健康對照，HDL水平與ESR和IgG，以及炎性細胞因子TNF-α和IL-6呈顯著負相關(guān)，細胞實驗證明HDL可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α及IL-6產(chǎn)生，表明在pSS中HDL與炎癥水平相關(guān)，并可能發(fā)揮抗炎作用。本研究提示重組HDL或升高HDL藥物有望抑制pSS患者的炎癥狀態(tài)，緩解并改善pSS患者的癥狀。