茹克亞木·色麥提，迪拉拉·吐爾遜

新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院 a.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)一科；b.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)二科；新疆 喀什844000

流感病毒性肺炎是一種由病毒感染引起的比較嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎，具有發(fā)病率高、危重、死亡率高等特點(diǎn)。炎癥反應(yīng)是機(jī)體重要的免疫防御機(jī)制，有助于機(jī)體抵抗病原微生物感染。研究表明，病毒侵入機(jī)體后，若不能被及時清除，流感病毒性肺炎患者會產(chǎn)生過度的炎癥免疫應(yīng)答，導(dǎo)致肺組織的實(shí)質(zhì)性損傷[1]。因此，探究流感病毒性肺炎患者炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制已成為目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。microRNA（miRNA）是一類非編碼內(nèi)源性小RNA，它們通過與靶基因的3'端非編碼區(qū)結(jié)合，下調(diào)靶基因的表達(dá)水平，對生物體中許多基本生命過程起重要的調(diào)控作用。miR-124-3p作為一種炎癥相關(guān)miRNA，在許多炎癥疾病的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[2-3]，但其是否參與調(diào)控流感病毒性肺炎的炎癥反應(yīng)未見報(bào)道。本研究初步探討miR-124-3p在流感病毒性肺炎中的表達(dá)及其對炎癥反應(yīng)的影響，并初步研究其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

昆明小鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，雌雄各半，體重18～20 g；流感病毒亞洲甲型鼠肺適應(yīng)株（FM1）由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提供。參考萬巧鳳[4]等的方法，在廣州海關(guān)技術(shù)中心生物安全檢測國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立病毒性肺炎小鼠模型，肺組織出現(xiàn)組織充血和水腫為模型建立成功。

293T細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；TLR4、核轉(zhuǎn)錄因子（NF）κB p65、GAPDH、核纖層蛋白A（Lamin A）抗體及HRP標(biāo)記二抗，白細(xì)胞介素（IL）1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）α的ELISA試劑購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；蛋白雙染marker、顯影液、脫脂奶粉、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒、TRIzol試劑購自上海生工生物科技有限公司；miR-124-3p agomir及陰性對照購自Promega公司；核蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 注射及分組

取30只建模成功的小鼠分為3組，每組各10只。模型組，尾部注射PBS緩沖液；agomir NC對照組，尾部注射agomir NC（無義序列）；miR-124-3p agomir組，尾部注射miR-124-3p agomir。連續(xù)注射3 d，注射劑量參考文獻(xiàn)[5]，第4 d摘眼球取血并取出肺組織稱量備用。另取10只同齡昆明小鼠作為正常組。

1.3 RT-qPCR檢測miR-124-3p的表達(dá)

TRIzol法抽提10只病毒性肺炎小鼠和10只正常小鼠肺組織的RNA，分別采用一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒檢測miR-124-3p的表達(dá)。miR-124-3p上游引物為5'-TGAGGGCCCCTCTGCGTG TTCA-3'，下游引物為5'-GGAGGCGCCTCTCTTG GCATTC-3'。以U6為內(nèi)參，U6上游引物為5'-G CTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTT CACGAATTTGCGT-3。

1.4 ELISA檢測IL-1β、IL-6、TNF-α的水平

將采集的血液以3000 r/min離心5 min，收集血漿，采用ELISA試劑盒檢測血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。

1.5 HE染色

各組肺組織按1.5 cm×1.5 cm×0.4 cm大小取材，用10%甲醛固定，石蠟包埋后HE染色進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.6 核質(zhì)分離

各組肺組織中加入 200～500 μL PBS，用勻漿器冰上勻漿制成細(xì)胞懸液，500 r/min離心2～3 min收集細(xì)胞，吸盡上清，收集沉淀，加入200 μL漿蛋白，用移液器吹打或高速渦旋15 s，冰浴10 min，劇烈渦旋 10 s，4℃、12 000～16 000 r/min離心10 min，上清即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白。

1.7 Western印跡檢測蛋白水平

各組肺組織中分別加入RIPA裂解液，冰上裂解20 min，4℃、13 000 r/min離心20 min，上清即為抽提得到的細(xì)胞蛋白。采用BCA試劑盒測定細(xì)胞蛋白或細(xì)胞核蛋白含量。取35 μg蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，用封閉液（2%BSA）封閉，分別加入一抗后4℃過夜（以GAPDH和Lamin A抗體為參照），洗滌后，再加入二抗室溫孵育1 h。ECL曝光成像，最后采用Alpha Imager HP凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用x±s表示；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，多組比較采用單因素方差分析，2組比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 病毒性肺炎小鼠肺組織中miR-124-3p的表達(dá)情況

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，miR-124-3p在模型組、正常組、miR-124-3p agomir注射組、agomir NC組的相對表達(dá)量依次為8.12±0.14、26.64±0.24、14.99±0.39、8.11±0.10，4組組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12 768.00，P＜0.001）；病毒性肺炎小鼠肺組織中miR-124-3p的相對表達(dá)量與正常小鼠肺組織相比，明顯降低（q=239.40，P＜0.001）；miR-124-3p agomir注射組鼠肺組織中miR-124-3p的表達(dá)量明顯高于agomir NC組（q=88.95，P＜0.001）。

2.2 注射miR-124-3p抑制小鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)

各組血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FIL-1β=80.49，P＜0.001；FIL-6=1046.00，P＜0.001；FTNF-α=7500.00，P＜0.001）。miR-124-3p agomir注射組血漿中 IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平明顯低于agomir NC組（qIL-1β=122.70，P＜0.001；qIL-6=47.47，P＜0.001；qTNF-α=136.00，P＜0.001）和模型組（qIL-1β=126.60，P＜0.001；qIL-6=45.64，P＜0.001；qTNF-α=132.80，P＜0.001），而 miR-124-3p agomir注射組血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平明顯高于正常 組（qL-1β=25.30，P＜0.001；qIL-6=16.43，P＜0.001；qTNF-α=28.46，P＜0.001）。見表1。

表1 miR-124-3p對小鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)的影響

圖1 miR-124-3p對肺組織病理形態(tài)的影響（HE×200）

2.3 注射miR-124-3p減輕小鼠肺組織的炎癥

HE染色切片（圖1）顯示，正常組小鼠的肺組織肺泡和支氣管結(jié)構(gòu)清晰完整，支氣管周圍肺間質(zhì)內(nèi)未見炎癥細(xì)胞浸潤和滲出；模型組和agomir NC組小鼠肺組織肺泡間隔增厚，間質(zhì)內(nèi)血管明顯擴(kuò)張，肺泡腔內(nèi)充滿漿液性滲出物，支氣管周圍肺間質(zhì)內(nèi)可見大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤；miR-124-3p agomir注射組小鼠肺組織病理改變較輕，只有少量炎細(xì)胞滲出和浸潤。

2.4 注射miR-124-3p抑制小鼠TLR4和NF-κB p65的表達(dá)

Western印跡結(jié)果表明，各組肺組織TLR4、NF-κB p65和細(xì)胞核NF-κB p65的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FTLR4=372.80，P＜0.001；FNF-κBp65=251.10，P＜0.001；F核NF-κBp65=362.80，P＜0.001）。miR-124-3p agomir注射組小鼠肺組織中TLR4、NF-κB p65和細(xì)胞核NF-κB p65的表達(dá)明顯低于模型組（qTLR4=38.02，P＜0.001；qNF-κBp65=33.95，P＜0.001；q核NF-κBp65=38.41，P＜0.001）和agomir NC組（qTLR4=37.97，P＜0.001；qNF-κBp65=33.09，P＜0.001；q核NF-κBp65=39.55，P＜0.001），而 miR-124-3p agomir注射組小鼠肺組織中TLR4、NF-κB p65和細(xì)胞核NF-κB p65的表達(dá)明顯高于正常組（qTLR4=10.91，P＜0.001；qNF-κBp65=20.09，P＜0.001；q核NF-κBp65=16.00，P＜0.001）。見圖2、表2。

3 討論

miRNA作為小RNA中的一種，與腫瘤、心血管疾病、糖尿病、人類遺傳疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Huang[6]等研究表明miR-127-3p、miR-493-5p和miR-409-3p在流感病毒性肺炎患者血漿中的表達(dá)存在差異，通過生物信息學(xué)預(yù)測miR-127-3p、miR-493-5p和miR-409-3p的靶基因，其對應(yīng)的大多數(shù)靶基因都參與了MAPK/ERK信號通路的活化。Liu[7]等研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體病毒感染后會上調(diào)miRNA-200c-3p的表達(dá)，通過負(fù)向調(diào)控血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）加重肺損傷。因此，miRNA在流感病毒性肺炎發(fā)病機(jī)理中可能起關(guān)鍵作用。

圖2 miR-124-3p對肺組織中TLR4、NF-κB p65和細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)的影響

表2 miR-124-3p對肺組織中TLR4、NF-κB p65和細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)的影響（倍數(shù)）

miR-124是一種在免疫細(xì)胞和器官如骨髓、淋巴結(jié)、胸腺和外周血單核細(xì)胞中高表達(dá)的保守性miRNA，以miR-124-3p及miR-124-5p兩種形式存在，但以miR-124-3p為主。miR-124-3p在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)被首次發(fā)現(xiàn)，被證實(shí)能夠緩解阿爾茨海默病等多種類型的神經(jīng)退行性疾病中的神經(jīng)元死亡；此外還被證實(shí)能夠抑制甲狀腺癌等多種腫瘤的增殖與遷移，發(fā)揮抑癌作用[8-11]。值得注意的是，Zhang[3]等研究指出miR-124-3p通過靶向TRAF6可抑制腎小球系膜細(xì)胞的生長和炎癥反應(yīng)。Ma[12]等發(fā)現(xiàn)miR-124-3p直接抑制Toll樣受體 6（TLR6）、髓樣分化因子 88（MyD88）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）、TNF-α等TLR信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，減輕肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。以上研究提示miR-124-3p是一個抗炎因子。本研究發(fā)現(xiàn)miR-124-3p在流感病毒亞洲甲型鼠肺適應(yīng)株（FM1）感染所致病毒性肺炎小鼠肺組織中表達(dá)下調(diào)。由此，我們推測miR-124-3p可能在調(diào)控流感病毒性肺炎的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用?；诖私Y(jié)果，本研究將miR-124-3p agomir注射到病毒性肺炎小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α明顯降低，肺組織炎細(xì)胞滲出和浸潤減輕。進(jìn)一步證實(shí)miR-124-3p在流感病毒性肺炎中發(fā)揮抗炎作用。

TLR4是先天免疫受體，參與機(jī)體免疫調(diào)控和炎癥反應(yīng)。流感病毒感染肺泡巨噬細(xì)胞后，激活TLR4信號通路，引發(fā)NF-κB活化和促炎癥因子產(chǎn)生，從而損傷肺組織[13-14]。通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測到miR-124-3p可以與TLR4的3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，且Su[15]等應(yīng)用雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-124-3p對TLR4有靶向調(diào)控作用。此外，在病毒性肺炎小鼠體內(nèi)注入miR-124-3p agomir降低了TLR4和NF-κB p65的表達(dá)，并且減輕了炎癥反應(yīng)。結(jié)合上文我們可以推測miR-124-3p通過靶向TLR4阻斷NF-κB通路抑制流感病毒性肺炎的炎癥反應(yīng)，與Li[16]等的研究結(jié)果相同，他們發(fā)現(xiàn)miR-124-3p通過抑制TLR4/NF-κB/CCL2減輕高氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

本研究初步探究了miR-124-3p靶向抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕流感病毒性肺炎的炎癥反應(yīng)，但值得注意的是，miRNA對靶基因的調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜，一個miRNA可能調(diào)控若干靶基因。因此，需要進(jìn)一步研究miR-124-3p在流感病毒性肺炎中的具體機(jī)制。