孫小艷 張曉艷

結(jié)直腸癌(CRC)是全球第三大常見癌癥，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第四大主要原因[1]。盡管在外科手術(shù)和輔助化療方面取得了進(jìn)展，但仍有20%～25%的患者在治療性手術(shù)后復(fù)發(fā)[2]。國際癌癥控制聯(lián)盟(UICC)的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期系統(tǒng)(TNM)是目前評估患者預(yù)后的最可靠指標(biāo)[3]。然而，即使在 TNM 早期階段，患者預(yù)后也存在差異，需要更可靠的標(biāo)志物來提高癌癥復(fù)發(fā)和患者生存的預(yù)測準(zhǔn)確性。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是位于胞核或胞漿的一類長度大于200 nt的非編碼RNA的總稱，lncRNA 介導(dǎo)的生物學(xué)特征已被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于各種癌細(xì)胞演進(jìn)進(jìn)程中，其表達(dá)受發(fā)育調(diào)控，具有組織和細(xì)胞特異性，近年來已成為腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。SChLAP1 是一種新型的lncRNA，Prensner等[4]研究認(rèn)為SChLAP1在前列腺癌的一個亞型中高度過表達(dá)，參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。最近，有研究者通過qRT-PCR檢測到SChLAP1在膀胱癌中表達(dá)[5]，但在CRC的預(yù)后評估中的作用及其與生存率的關(guān)系尚不清楚。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

從 2007年—2014年在沈陽腫瘤醫(yī)院和丹東第一醫(yī)院病理與腫瘤組織庫隨機(jī)抽取 156 例CRC術(shù)后新鮮組織標(biāo)本。對年齡、性別、腫瘤大小、TNM 分期、CEA 水平、無病生存期(DFS)、總生存期(OS)等資料進(jìn)行了詳細(xì)回顧?；颊吣挲g在 31～76 歲之間，平均年齡51.6±2.3歲。男女比例為2.71∶1。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會第六屆會議制定的腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期[6]。在 156 例 CRC 標(biāo)本中，87 例為早期(Ⅰ～ⅡA)，69 例為晚期(ⅡB～Ⅳ)。所有患者在手術(shù)前均未接受過化療和放療。以43例癌旁結(jié)直腸組織為對照。

1.2 RNA 提取和 qRT-PCR

使用試劑盒(TaKaRa公司，日本)根據(jù)制造商的說明書提取組織樣本的總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄酶引物合成第一鏈cDNA(TaKaRa公司，日本)和低聚糖(dT)。PCR反應(yīng)都是在20 μL反應(yīng)物中，以94℃變性4 min開始，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增23～36周期，94℃ 15 min和53～58℃ 30 s，引物退火，并引物在72℃延長1 min，在3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳[6]。用Champchemi專業(yè)圖像分析系統(tǒng)(賽智公司，中國)和LANE 1D軟件對蛋白條帶進(jìn)行量化。實(shí)時定量PCR是由Bio-Rad序列檢測系統(tǒng)根據(jù)制造商的指示使用雙鏈DNA-specific SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(TaKaRa公司，日本)重復(fù)三次，用2-ΔΔCt法計算待測樣本mRNA相對表達(dá)量。SChLAP1引物：5′-CGGAGAGGATGGGCTCTGGCATT-3′，5′-AGGGACCCTTCAGGGTGGCTG-3′；GAPDH引物：5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，5′-CCATGTAGT TGAGGTCAATGAAG-3′。

1.3 隨訪

所有患者隨訪5年時間，最終截止到2019年3月，89 名患者死亡，67名患者生存。總生存期(OS)是指從病人確認(rèn)患病起至任何原因引起死亡的時間，無病生存期(DFS)是指隨機(jī)化開始直到腫瘤復(fù)發(fā)或因各種原因出現(xiàn)死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包(SPSS Inc.，美國)，CRC及癌旁組織中SChLAP1表達(dá)水平的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，SChLAP1表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系比較用卡方檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間生存曲線比較使用Log-rank檢驗(yàn)；Cox風(fēng)險回歸模型分析OS和DFS的影響因素，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SChLAP1 在 CRC中表達(dá)情況

應(yīng)用 qRT-PCR 檢測 156 例 CRC 患者和43例癌旁結(jié)直腸組織SChLAP1 表達(dá)水平。結(jié)果顯示，SChLAP1 在癌組織中表達(dá)高于癌旁組織(t=13.662，P<0.001)(圖 1)。

圖1 qRT-PCR檢測SChLAP1在CRC和癌旁組織中的表達(dá)Figure 1 The expression of SChLAP1 in CRC and adjacent tissuesNote：The level of SChLAP1 mRNA in CRC tissues was significantly higher than that in adjacent tissues.**P<0.01.

2.2 SChLAP1 表達(dá)與CRC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

以 SChLAP1 的中位表達(dá)水平(2.823)作為界值，將156例患者分為高、低兩組。SChLAP1的高表達(dá)率與CRC分化程度(P=0.002)和TNM分期(P=0.006)有關(guān)，而與其它參數(shù)無關(guān)(表1)。

2.3 SChLAP1表達(dá)與CRC患者OS和DFS的關(guān)系

Kaplan-Meier分析156例CRC患者DFS和OS與SChLAP1 表達(dá)的關(guān)系，SChLAP1高表達(dá)患者DFS較低表達(dá)者明顯降低(χ2=13.318，P<0.001)，而SChLAP1高表達(dá)患者OS也較低表達(dá)者明顯降低(χ2=10.910，P<0.001)(圖2)。

2.4 影響CRC生存期的獨(dú)立預(yù)后風(fēng)險因素分析

Cox風(fēng)險回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小(OS：P=0.047，DFS：P=0.020)、臨床分期(OS：P<0.001，DFS：P<0.001)、漿膜侵犯(OS：P=0.007，DFS：P=0.005)與SChLAP1(OS：P=0.042，DFS：P=0.039)過表達(dá)都是CRC患者OS和DFS重要的獨(dú)立預(yù)后風(fēng)險因素(表2-3)。

表1 SchLAP1高表達(dá)與156例CRC的臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

圖2 Kaplan-Meier分析156例CRC患者DFS和OS與SChLAP1 表達(dá)的關(guān)系Figure 2 The expression of SChLAP1 expression in 156 CRC patients with the DFS and OS by Kaplan-Meier analysisNote：A.The DFS in CRC patients with SChLAP1 high-expression(H)had lower than that in CRC patients with SChLAP1 low-expression(L)(χ2=13.318，P<0.001).B.The OS in CRC patients with SChLAP1 high-expression had lower than that in CRC patients with SChLAP1 low-expression(χ2=10.910，P<0.001).

表2 156例CRC患者OS影響因素的單因素和多因素分析影響

表3 156例CRC患者DFS影響因素的單因素和多因素分析影響

3 討論

CRC是全世界第三常見的惡性腫瘤[7]，晚期腫瘤的轉(zhuǎn)移和死亡率呈明顯上升趨勢[8]。揭示進(jìn)展性癌癥的發(fā)病機(jī)制可以解開結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的起因、探索腫瘤治療的干預(yù)措施，并協(xié)助開發(fā)預(yù)防及治療藥物。盡管有了手術(shù)切除及放化療等較為先進(jìn)的治療手段和技術(shù)，CRC患者5年生存率和生活質(zhì)量仍未見明顯改善，尤其是晚期CRC。尋找能夠早期確診的生物標(biāo)志物、針對腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展相關(guān)基因?qū)嵤┑闹委煷胧┦歉深A(yù)CRC腫瘤演進(jìn)、降低復(fù)發(fā)和死亡率的關(guān)鍵[9]。

隨著芯片和新一代測序高通量技術(shù)等的發(fā)展，lncRNA在轉(zhuǎn)錄組中的重要地位已明確，具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞分化、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、染色質(zhì)修飾和細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)之間的運(yùn)輸?shù)榷喾N功能，在腫瘤形成、預(yù)后標(biāo)志物作用、治療模式風(fēng)險預(yù)測等方面起著非常重要的作用[10]。因此，深入研究CRC相關(guān)lncRNAs的分子調(diào)控機(jī)制可以為早期診斷和預(yù)后評估提供有效的生物標(biāo)志物和新的分子治療靶點(diǎn)，為臨床制定相應(yīng)的治療策略提供新思路。

lncRNA-SchLAP1被命名為與前列腺-1相關(guān)的第二個染色體基因座，也稱為LINC00913，是一種新興的 RNA 分子，是侵襲性疾病演進(jìn)過程的重要介質(zhì)，包括腫瘤侵襲和血源性傳播[11]。SChLAP1 通過與 SWI/SNF 表觀遺傳復(fù)合物的拮抗作用進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而 SWI/SNF 表觀遺傳復(fù)合物負(fù)責(zé)組蛋白在基因啟動子上的定位。SWI/SNF 是許多癌癥(包括前列腺癌)中明確定義的腫瘤抑制因子，通過基因突變或核心亞基的缺失而失活。另外，SWI/SNF復(fù)合物與已知的腫瘤抑制基因和癌基因產(chǎn)物如RB、BRCA1、c-MYC和MLL之間也直接發(fā)生作用。通過干擾 SWI/SNF 功能，SChLAP1 導(dǎo)致成百上千基因表達(dá)的改變，這可能促進(jìn)整個轉(zhuǎn)移級聯(lián)，而不是通過單一的信號通路，潛在地增強(qiáng)早期去勢抗性和死亡風(fēng)險[12-15]。已有報道提出SWI/SNF核心元件BRG-1和催化亞單位BRMS1的缺陷可促進(jìn)CRC的擴(kuò)散，但目前尚不清楚這些蛋白是否與內(nèi)源性 SWI/SNF 酶亞基共同作用或獨(dú)立作用[16]。而SChLAP1已被發(fā)現(xiàn)在前列腺癌和膀胱癌中上調(diào)，在 CRC 中的確切作用尚不清楚。我們因此大膽預(yù)測SChLAP1也可能在CRC的演進(jìn)中起到一定的作用而檢測了 SChLAP1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) SChLAP1 在 156 個 CRC 組織中的表達(dá)高于 43個癌旁組織；SChLAP1 高表達(dá)與分化、臨床分期顯著相關(guān)；在生存方面，我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá) SChLAP1 的 CRC 患者比低表達(dá) SChLAP1 的患者有更低的DFS和OS；最后，多因素生存分析表明，SChLAP1 高表達(dá)和臨床分期、漿膜浸潤、腫瘤大小同時成為 CRC 生存的獨(dú)立風(fēng)險因素，而臨床分期、漿膜浸潤、腫瘤大小是被公認(rèn)具有預(yù)后評估意義的臨床參數(shù)，說明SChLAP1對CRC的預(yù)后評估有一定的意義。

了解 SChLAP1 在 CRC 中的關(guān)鍵作用可能會導(dǎo)致一種新型診斷標(biāo)記物的開發(fā)。然而，SChLAP1 調(diào)控 CRC 腫瘤遷移和侵襲的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。由于本研究首次報道了 SChLAP1 在 CRC 中的生物學(xué)功能，因此需要在大量樣本中進(jìn)行進(jìn)一步研究，并對其他可能的作用機(jī)制進(jìn)行研究。