蘇俊 張?jiān)泼?王梗伊 陳琪 張潔靜 朱舒明

水楊酸鈉(sodium salicylate, SS)在臨床上普遍用于解熱鎮(zhèn)痛和抗炎、預(yù)防心肌梗塞、心絞痛以及中風(fēng)等。耳毒性是水楊酸鈉最常見的不良反應(yīng)，現(xiàn)已證明，大劑量水楊酸鈉是聽力損失和耳鳴的可能誘因，但其藥物的慢性和急性作用機(jī)制還不完全清楚[1]。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是從川芎中提取的一種生物堿單體: 4-甲基吡嗪，川芎具有抑制自由基產(chǎn)生、提高內(nèi)源性超氧化物歧化酶活性、清除自由基、改善血液流變學(xué)、抗脂質(zhì)過氧化等藥理作用[2]，王晨露等[3]研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪能有效防護(hù)慶大霉素的耳毒性損傷。本研究擬通過觀察長期注射水楊酸鈉致大鼠聽損傷，并應(yīng)用川芎嗪加以拮抗，探討中藥川芎嗪對長期注射水楊酸鈉致聽損傷耳毒性的拮抗效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 雄性SPF級SD大鼠50只(8周齡，體重180～200 g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，耳廓反射靈敏，無強(qiáng)噪聲暴露及耳毒性藥物使用史，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水對照組(saline control group，SC組)16只、水楊酸鈉組(SS組)17只，川芎嗪治療組(TMP+SS組)17只；所有大鼠均在屏蔽環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)4～5只，溫度22±2 ℃，濕度50%～60%，光照每12 h明暗交替，換風(fēng)次數(shù)15～20次/小時(shí)，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料和水，環(huán)境噪聲小于40 dB A。

1.2各組大鼠給藥劑量及方法 SC組：腹腔注射生理鹽水2.5 ml/kg，每天一次，連續(xù)14天；SS組：水楊酸鈉用生理鹽水配置，濃度為50 mg/ml，按400 mg/kg腹腔注射，每天一次，連續(xù)14天；TMP+SS組：先腹腔注射400 mg/kg水楊酸鈉溶液后，立即于對側(cè)腹腔注射40 mg/kg鹽酸川芎嗪溶液，每天一次，連續(xù)14天。每天注射前各組動(dòng)物稱體重并記錄。

1.3畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)檢測 各組動(dòng)物完成給藥后于第15天進(jìn)行DPOAE檢測，檢測儀器為校準(zhǔn)過的Smart OAE耳聲發(fā)射儀。大鼠經(jīng)8%水合氯醛40 mg/kg麻醉后，在環(huán)境噪聲<30 dB A的隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行檢測。兩個(gè)純音的初始強(qiáng)度為L1=65 dB SPL，L2=55 dB SPL，f2/f1=1.22，記錄f2頻率為1 000、2 000、3 000、4 000、6 000 Hz時(shí)2f1-f2處的DPOAE反應(yīng)幅值。

1.4聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試 各組動(dòng)物完成給藥后于第15天進(jìn)行ABR檢測，檢測儀器為校準(zhǔn)過的GSI Audera聽覺誘發(fā)電位儀。大鼠經(jīng)8%水合氯醛40 mg/kg麻醉后，在環(huán)境噪聲<30 dB A的隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行檢測。記錄電極置于兩側(cè)外耳道口與顱正中線交叉處皮下，參考電極位于同側(cè)耳后乳突皮下，接地電極置于鼻尖正中皮下，刺激聲為短聲，插入式耳機(jī)單側(cè)給聲，刺激速率為21.1次/秒，帶通濾波0.1～3 kHz，疊加次數(shù)2 048次，掃描時(shí)間為10 ms，測試聲強(qiáng)由80 dB nHL開始，以5 dB遞減，以波Ⅱ最后消失的上一強(qiáng)度作為反應(yīng)閾，記錄雙耳ABR閾值和潛伏期。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 21.0軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1三組大鼠用藥后的體重變化 在連續(xù)用藥14天后，SS組和TMP+SS組大鼠精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、毛色晦暗，且SS組尿量明顯增多，TMP+SS組和SS組大鼠分別在注射后第9、12天各死亡1只。在連續(xù)用藥第7天和14天，SS組、TMP+SS組與SC組相比體重明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SS組和TMP+SS組相比，體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 各組SD大鼠用藥后第1、7、14天體重比較(n=16只)

2.2各組用藥后DPOAE幅值比較 在連續(xù)用藥14天后，第15天，在f2為1 000、2 000、3 000、4 000、6 000 Hz時(shí)，SS組DPOAE幅值較SC組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TMP+SS組與SC組相比，DPOAE幅值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在f2為1 000、4 000、6 000 Hz時(shí)，SS組DPOAE幅值較TMP+SS組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2，圖1)。

表2 各組SD大鼠1 000～6 000 Hz DPOAE幅值(dB SPL,

2.3用藥后各組ABR反應(yīng)閾及潛伏期比較 在連續(xù)用藥14天后，第15天，SS組與SC組相比，ABR閾值升高，波Ⅱ潛伏期延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TMP+SS組與SC組比較，波Ⅱ潛伏期延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SS組與TMP+SS組波Ⅱ潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 各組ABR反應(yīng)閾值(dB nHL)和波Ⅰ、Ⅱ潛伏期(ms)比較(n=32耳)

3 討論

耳毒性是水楊酸鈉最常見的不良反應(yīng)，學(xué)者們一直在從聽覺系統(tǒng)的各個(gè)層面研究水楊酸鹽的毒副作用[4～6]。研究發(fā)現(xiàn)150 mg/kg或更高劑量的水楊酸鈉可產(chǎn)生耳毒性不良反應(yīng)[1]，因此本實(shí)驗(yàn)采用常見的長期腹腔注射水楊酸鈉400 mg·kg-1·d-1的方法來制備大鼠長期注射水楊酸鈉耳毒性動(dòng)物模型。川芎嗪是中藥川芎中提取的有效成分，其化學(xué)本質(zhì)是一種鈣通道阻滯劑，可調(diào)節(jié)鈣離子在細(xì)胞內(nèi)外的分布，從而保護(hù)血管內(nèi)皮，改善缺血部位血液供應(yīng)，減輕或逆轉(zhuǎn)組織壞死狀況[7]。石麗娟等[8]研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪能拮抗鏈霉素的耳毒性；孫憲昌等[9]發(fā)現(xiàn)川芎嗪能拮抗順鉑的耳毒性；故本研究擬觀察川芎嗪是否對水楊酸鈉的耳毒性有拮抗作用。從文中結(jié)果看，與生理鹽水對照組(SC組)相比，水楊酸鈉組(SS組)和川芎嗪治療組(TMP+SS組)出現(xiàn)體毛稀疏、活動(dòng)量減少、反應(yīng)遲鈍、蜷縮群集、體重下降、尿量增多、大便稀等現(xiàn)象。在連續(xù)用藥第7天和14天，SS組和TMP+SS組與SC組相比體重明顯減輕(P<0.05)；SS組和TMP+SS組相比，體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明長期注射水楊酸鈉有明顯的毒副作用，可造成大鼠體重明顯減輕，且川芎嗪對水楊酸鈉致體重減輕的拮抗作用不明顯。

Huang等[10]研究發(fā)現(xiàn)急性注射水楊酸鈉后豚鼠DPOAE幅值多呈可逆性降低，長期注射水楊酸鈉使豚鼠DPOAE的幅值上升。本研究結(jié)果顯示連續(xù)用藥14天后，第15天在f2為1 000、2 000、3 000、4 000、6 000 Hz時(shí)，與SC組相比，SS組DPOAE幅值升高(P<0.05)，與Huang等[10]研究結(jié)果相同。說明水楊酸鈉組SD大鼠出現(xiàn)了明顯的耳毒性。此外，TMP+SS組與SC組相比，DPOAE幅值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與TMP+SS組相比，在f2為1 000、4 000、6 000 Hz時(shí)SS組DPOAE幅值升高(P<0.05)，同時(shí)各頻率DPOAE幅值均值SS組>TMP+SS組>SC組，說明川芎嗪對長期注射水楊酸鈉耳毒性導(dǎo)致的DPOAE幅值升高有明顯的拮抗作用，但不能完全扭轉(zhuǎn)水楊酸鈉的耳毒性。

最近的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明ABR可能作為一種客觀的方法來揭示耳鳴引起的聽覺系統(tǒng)的改變[11]。Lowe等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在腹腔注射水楊酸鈉250 mg/kg后3小時(shí)，ABR反應(yīng)閾值平均增加21±1.6 dB，Castaeda等[11]研究發(fā)現(xiàn)口服水楊酸鈉350 mg/kg 3天后，ABR閾值明顯增高，而停藥3天后ABR閾值恢復(fù)正常。在嚙齒動(dòng)物中，ABR波Ⅰ與聽神經(jīng)誘發(fā)的電位有關(guān)，而波Ⅱ～Ⅴ則與耳蝸核、上橄欖復(fù)合體、外側(cè)丘系、下丘和內(nèi)側(cè)膝狀體等中樞結(jié)構(gòu)有關(guān)[13]。大鼠ABR波形和人類類似，但順序不同，例如：大鼠的波Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別與人類的波Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ相匹配。本研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠ABR的波Ⅱ幅值最高，且波Ⅱ的出現(xiàn)率最高也最穩(wěn)定，與Castaeda等[11]研究相同，因此以波Ⅱ最后消失為閾值判定方法。本研究結(jié)果顯示，持續(xù)用藥14天后，第15天，與SC組相比，SS組ABR閾值升高(P<0.05),與Lowe[12]和Castaeda[11]研究相似，但他們的研究顯示ABR反應(yīng)閾增高明顯，而本研究SS組ABR閾值升高幅度不如前者明顯，原因可能為Lowe和Castaeda記錄的為急性注射水楊酸鈉引起的ABR閾值變化，而本研究記錄的是長期注射水楊酸鈉引起的ABR閾值變化。同時(shí)，本研究SS組與SC組相比，click聲ABR波Ⅰ潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，波Ⅱ潛伏期延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而Castaeda等[11]研究顯示在8、16、24 kHz的短純音刺激聲下各波潛伏期縮短，而在click聲和32 kHz短純音刺激下，各波潛伏期延長，提示ABR各波潛伏期的差異取決于頻率。本研究與Castaeda等[11]研究結(jié)果不同，提示急性注射水楊酸鈉和長期注射水楊酸鈉對ABR閾值和潛伏期的影響亦存在差異，需要進(jìn)一步詳細(xì)研究。本研究結(jié)果還顯示，TMP+SS組與SC組相比，ABR閾值、波Ⅰ潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，波Ⅱ潛伏期延長(P<0.05)，提示川芎嗪對長期注射水楊酸鈉導(dǎo)致的ABR反應(yīng)閾值和潛伏期變化有一定的拮抗作用。

綜上所述，川芎嗪對長期注射水楊酸鈉耳毒性的拮抗作用相對較弱，能部分拮抗長期注射水楊酸鈉引起的DPOAE幅值增高，但對其引起的ABR反應(yīng)閾值和潛伏期改變的拮抗作用還需要進(jìn)一步研究。