伍 燕，張倩倩，張 娟，易君明

(興義民族師范學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，貴州 興義 562400)

香樟(CinnamomumcamphoraL.Presl)為樟科(Lauraceae)樟屬喬木，又名樟木、烏樟、番樟、芳樟等，在我國主要分布于長江流域及南方[1]。香樟作為原料可提取樟腦、樟油，廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥衛(wèi)生及香精香料工業(yè)[2-3]，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為香樟具有溫中止痛、解毒消腫等療效，現(xiàn)代藥理研究表明香樟具有抑菌、抗氧化、趨避、拒食和殺蟲等活性[4-5]，香樟在南方是常綠喬木，樹形挺拔秀美且具有一定程度的吸收凈化尾氣、滯納重金屬及滯塵能力，因而在城市綠化中應(yīng)用較廣[6-7]。

香樟全株散發(fā)特有的香樟味，主要揮發(fā)油成分有芳樟醇、1,8-桉葉油素、樟腦、異-橙花叔醇和龍腦等天然成分，但不同地域及氣候條件下生長的香樟揮發(fā)油成分不相同，如張國防等發(fā)現(xiàn)福建省的樟樹(Cinnamomumcamphora) 存在芳樟型、腦樟型、桉樟型、黃樟型和雜樟型等5種化學(xué)類型[8]，也有的研究者依據(jù)精油中主要成分把香樟分為油樟、腦樟、芳樟、異樟和龍腦樟[9]。貴州興義地區(qū)氣候溫潤多雨，香樟生長繁茂，對其揮發(fā)油的成分研究還未見報道，本研究以貴州興義產(chǎn)香樟為研究對象，水蒸氣蒸餾法提取精油，對其可揮發(fā)性成分進(jìn)行GCMS分析，采用對倍稀釋法對常見病原菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、白色念珠菌原菌、熱帶假絲酵母菌、蘋果斑點落葉病原菌、油菜黑斑病和核桃膏藥病原菌進(jìn)行了抑菌實驗；為了解香樟精油的抗氧化活性，檢測了不同濃度香樟精油對DPPH、ABTs和OH自由基的清除效果，以期為興義香樟的開發(fā)利用和樹種選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

試驗材料：香樟(Cinnamomumcamphora)新鮮植株，8月份采集于興義民族師范學(xué)院校園內(nèi)。

實驗菌株：大腸桿菌(Escherichiacoil，ATCC-8739)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，ATCC-6633)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC-25923)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae，ATCC-4532)、白色念珠菌(Candidaalbicans，ATCC-10231)、熱帶假絲酵母菌(Candidatropicalis，ATCC-13803)。蘋果斑點落葉病原菌(Alternariamali)、油菜黑斑病原菌(Alternariabrassicae)和菌核桃膏藥病原菌(Septobasidiumbogoriense)，本實驗室分離保存。

藥品和試劑：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，青島科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；2,2’- 聯(lián)氨 -雙(3-乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸)二胺鹽、1,1-二苯基-2-苦肼基，麥克林試劑公司；水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、無水乙醇和二甲基亞砜、丙酮酸，二甲基亞砜、氯化鈉、無水乙醇、硫酸、氯化鋇等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司；YXQ-SL-100G高壓蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；LRH-250生化恒溫培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；DHG-9246A精宏電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FA2004電子分析天平 0.1 mg～200 g，常州科源電子儀器有限公司；BILON-HX-200冷卻水循環(huán)機，上海比朗儀器制造有限公司；7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司。

1.3 方 法

1.3.1 水蒸氣蒸餾法提取香樟精油

摘取新鮮的香樟葉片及果實200 g放入2000 mL圓底燒瓶中，加入1000 mL蒸餾水，用電熱套加熱，水蒸氣蒸餾法提取3～4 h至無揮發(fā)油產(chǎn)生，收集精油用無水Na2SO4除水干燥，4 ℃保存?zhèn)溆肹10]。

1.3.2 香樟精油可揮發(fā)成分分析

色譜柱：HP-5彈性石英毛細(xì)血管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)，載氣為高純氦氣，流速為1.45 mL/min，分流比50:1進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度280 ℃，程序升溫為柱溫80 ℃，3 ℃/min的速率升至240 ℃。

質(zhì)譜條件[11]：電子轟擊(EI)能量70 eV，離子源溫度220 ℃，接口溫度250 ℃溶劑，延遲2 min，全掃描，質(zhì)量掃描范圍為50～400 m/z。

1.3.3 香樟精油抑菌活性的測定

精油樣品母液的配制：在分析天平上稱量0.5 g精油，加入到1.5 mL的EP管中用DMSO定容到1 mL，取20 μL溶于0.98 mL的LA或PDA中(稀釋50倍)，終濃度為10000 μg/mL記作A液；配2%DMSO的LA或PDA 10 mL培養(yǎng)基，記作B液；用接種環(huán)挑取微量各供試菌株到5 mL無菌水中懸浮，與濁度為1的麥?zhǔn)媳葷嵋哼M(jìn)行比對，取比對后的菌液10 μL加入到9.99 mL的LA或PDA中，記為C液，此時菌液濃度為1×105cfu。

在96孔板上采用微量對倍稀釋法測定香樟精油的最低抑菌濃度(MIC)，每個菌株一個96孔板，A1～A11孔為實驗組，A12孔為培養(yǎng)基空白對照組，重復(fù)三列。細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(LA)，真菌用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)，第1孔和第2孔各加100 μL的精油A液，第2～12孔各加100 μL培養(yǎng)基B液，依次對2～11孔做梯度稀釋；稀釋完后分別在1～12孔中加入100 μL的菌液(C液)，使得第1～11孔香樟精油的濃度為：5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.062、19.531、9.765和4.882 μg/mL。加完菌液的96孔板置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，比較檢驗組與空白對照組的混濁度的差異，無可見細(xì)菌生長、液體相對澄清且無沉淀的孔板內(nèi)所含的精油濃度即為最小抑菌濃度(MIC值)[12]。

1.3.4 香樟精油抗氧化活性的測定

(1)香樟精油工作液配制。稱取適量香樟精油，用無水乙醇定容成100 mg/mL母液，依次稀釋成80 mg/mL、60 mg/mL、40 mg/mL、20 mg/mL和10 mg/mL不同濃度工作液。

(2)ABTs·清除試驗[13]。取96孔板，依次加入不同濃度香樟精油50 μL，再加入150 μL的ABTs工作液，混勻、避光靜置6 min后，在734 nm波長處測定吸光度值，記作Ai(樣品吸光度值)；取精油不同濃度樣液50 μL，以ddH2O代替ABTs溶液，同法測定吸光度值，記作Aj(樣品本底吸光度值)；取50 μL的ddH2O加入150 μL的ABTs溶液，同法測定吸光度值，記作A0(陰性對照)，每個濃度重復(fù)3次。

ABTs自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(3)DPPH·清除試驗[14]。取96孔板，依次加入不同濃度香樟精油100 μL，加入0.1 mmol/L DPPH工作液100 μL，混勻、避光靜置30 min，在517 nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，記作Ai(樣品吸光度值)；另取不同濃度樣液100 μL加入無水乙醇100 μL，同法測定吸光度，記為Aj(樣品本底吸光度值)；另取無水乙醇 100 μL加入DPPH工作液100 μL，測定吸光度記為A0(陰性對照)。 DPPH清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

(4)·OH清除試驗[15]。取不同濃度樣液100 μL，依次加入9.0 mmol/L水楊酸乙醇溶液100 μL、9.0 mmol/L FeSO4溶液100 μL、8.8 mmol/L H2O2溶液100 μL啟動反應(yīng)，混勻后37 ℃水浴30 min，取200 μL各樣液在510 nm波長處測定吸光度，記為Ai(樣品吸光度值)；另以ddH2O代替樣液，同法測定，記為A0(陰性對照)。

·OH清除率=(A0-Ai)/A0×100%

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

用EXCEL 2010、ORINIG 9.0處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 香樟精油的主要成分

圖1為香樟精油可揮發(fā)性成分總離子流程圖，各組分質(zhì)譜碎片在質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫NIST 14中進(jìn)行匹配解析，匹配度達(dá)85%以上的有25個成分，占揮發(fā)性組分的97.19%，按峰面積歸一化法計算各成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如表1所示。

圖1 香樟精油揮發(fā)性成分總離子流程圖

表1 香樟精油的化學(xué)成分 Table 1 Chemical composition ofCinnamomum camphora essential oil

2.2 香樟精油對各供試菌株的抑制活性

香樟精油對不同病原菌的最小抑菌濃度見表2，由表可知，香樟精油對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、熱帶假絲酵母的抑制效果較好，最小抑菌濃度MIC值分別為9.77、19.53、156.25和9.77 μg/mL，對大腸桿菌沒有抑制活性；對植物病原菌引起的蘋果斑點落葉病、油菜黑斑病和核桃膏藥病菌有一定的抑制作用，MIC分別為1250、2500和625 μg/mL。

表2 香樟精油對不同病原菌生長的抑制(μg/mL)

1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分別表示5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.062、19.531、9.765和4.882 μg/mL。

2.3 香樟精油的抗氧化活性

圖2所示，香樟精油對ABTs和DPPH自由基具有良好的清除作用，經(jīng)各自回歸方程計算，EC50值分別為33.09和44.26 mg/mL，對OH自由基的清除作用不明顯。

圖2 香樟精油對ABTs、DPPH和OH自由基的清除率

3 結(jié) 論

水蒸氣蒸餾法提取的香樟精油，顏色呈淡黃色，散發(fā)濃郁的芳香味。經(jīng)GC-MS分析，共鑒定出25種物質(zhì)，主要成分是松油烯(29.69%)、異樟醇(12.36%)、乙酸肉桂酯(9.65%)、檸檬烯(9.41%)、α-松油醇(4.02%)、萜品油烯(3.93%)，這些成分為興義香樟特有香味的主要來源。如圖3所示，本研究中的主要成分都屬于單環(huán)單萜類，結(jié)構(gòu)上以萜烯和含氧萜烯為主。

圖3 香樟主要單萜類型

抑菌實驗表明，香樟精油對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、熱帶假絲酵母菌的抑制效果較好，對植物病原菌蘋果斑點落葉病、油菜黑斑病和核桃膏藥病菌有一定的抑制作用，對細(xì)菌和真菌的抑制作用與精油中豐富的松油烯、樟醇有關(guān)，這類次生代謝物有抑菌驅(qū)蟲、抗菌消炎的作用，其中具有倍半萜成分的沃伯格醛(warburganal)具有明顯的殺菌活性，倍半萜類成分的8,9-二醛基和7,8位不飽和的Drimane骨架化合物，對病原菌具有很強的拒食活性[16-17]。香樟精油的抗氧化活性表現(xiàn)良好，尤其對DPPH和ABTs自由基的清除效果較好，這與精油中豐富的萜類物質(zhì)有關(guān)[18]。香樟精油良好的抑菌活性及抗氧化活性，為深入了解和開發(fā)興義香樟的生物活性及經(jīng)濟價值提供了理論依據(jù)。