王惠民，曾瑜倩，翟曉敏，何 洋,2

(1 廣東藥科大學(xué)，廣東 中山 528458；2 廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣東 中山 528458)

砂仁為姜科植物陽春砂(AmomumvillosumLour.)、 綠殼砂 (AmomumvillosumLour. var. ranthioides T. L. Wu et Senjen)或海南砂(AmomumlongiligulreT. L. Wu)的干燥成熟果實(shí)。性溫，味辛。歸脾、胃、 腎經(jīng)。具有化濕開胃，溫脾止瀉，理氣安胎之功效[1]。陽春砂主產(chǎn)于廣東陽春市、信宜市等地，綠殼砂主產(chǎn)于云南西雙版納和文山等地，海南砂主產(chǎn)于海南，廣東和云南等地也有分布，以陽春砂質(zhì)量為優(yōu)質(zhì)[2-3]。砂仁是藥食兩用的中藥材，日常需求量大，市場上流通著許多以次充好、價格差異明顯的品種。砂仁及其常見混淆品種類較多，如草果、白豆蔻、印度砂仁和海南假砂仁等。目前，對中藥的鑒定方式主要有傳統(tǒng)的鑒別方式和現(xiàn)代鑒別方式?，F(xiàn)代鑒別方式主要有HPLC色譜指紋圖譜、GC色譜指紋圖譜、TLC色譜指紋圖譜以及紅外光譜指紋圖譜等[4]。其中，色譜指紋圖譜的研究和應(yīng)用最為廣泛和深入，已成為國際公認(rèn)的評價和控制中藥質(zhì)量的有效手段，但應(yīng)用色譜指紋圖譜技術(shù)樣品須經(jīng)提取和純化等預(yù)處理，得到指紋圖譜不能全面反映中藥材的信息。

電化學(xué)指紋圖譜，采用B-Z(Belousov-Zhabotinskii)化學(xué)振蕩體系，無需分離和提純等預(yù)處理技術(shù)，經(jīng)濟(jì)適用，操作簡單，可適用于成分復(fù)雜多樣的中藥材[5]。B-Z振蕩反應(yīng)機(jī)理涉及眾多基元反應(yīng)。在B-Z振蕩體系中加入中藥，由于不同種類、不同產(chǎn)地的中藥所含化學(xué)成分或者化學(xué)成分的含量不同，會對誘導(dǎo)和振蕩過程產(chǎn)生干擾或同時對振蕩體系中的反應(yīng)物與中間體產(chǎn)生不同影響，導(dǎo)致誘導(dǎo)過程和振蕩過程的特征參數(shù)不同，從而引起振蕩體系電位-時間(E-t)的變化[6-7]。

本文對中藥砂仁B-Z振蕩反應(yīng)的進(jìn)行了研究。以砂仁為反應(yīng)底物，將砂仁粉末加入H2SO4-Ce4+-CH2(COOH)2-BrO3-體系中，通過改變振蕩體系中H2SO4、Ce4+、CH2(COOH)2和BrO3-的濃度及反應(yīng)溫度等影響因素，確定體系最佳實(shí)驗條件，獲得不同產(chǎn)地砂仁的電化學(xué)指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地砂仁的電化學(xué)指紋圖譜主要特征參數(shù)有較大區(qū)別，可用于不同產(chǎn)地砂仁的定性分析。

1 材料與儀器

1.1 儀 器

CHI電化學(xué)工作站，北京華科普天科技有限公司；79-1磁力加熱攪拌器，常州澳華儀器有限公司；213型鉑片電極，213C(801)型甘汞電極，天津市蘭力科化學(xué)電子高科技有限公司；CP225D電子天平，德國賽多利斯。

1.2 試 劑

硫酸鈰銨，濃硫酸，溴酸鉀，丙二酸(均為分析純)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二次蒸餾水，為實(shí)驗室自制。

1.3 中藥材

砂仁：①采自廣東陽春，經(jīng)由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院滕希峰博士鑒別為姜科植物陽春砂的干燥成熟果實(shí)；②湖北金貴中藥飲片有限公司，產(chǎn)地：廣西，批號：A50904；③江西致和堂中藥飲片有限公司，產(chǎn)地：福建，批號：150501；④廣東盞王制藥有限公司，產(chǎn)地：湛江，批號：141118；⑤亳州市鑫康堂藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地：海南，批號：160320；⑥貴美康中藥材有限公司，產(chǎn)地：云南，批號：160110。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗方法

將超級恒溫水浴鍋調(diào)至37 ℃，維持恒溫，往帶有恒溫夾套的玻璃儀器中，加入干燥至恒重砂仁粉末(過四號篩)約0.15 g，精密稱定，再依次加入3.0 mol·L-1硫酸溶液12 mL、5 mmol·L-1硫酸鈰銨溶液3 mL和0.4 mol·L-1丙二酸溶液6 mL，蓋好帶電極和注射孔的反應(yīng)器蓋，開啟磁力攪拌器(轉(zhuǎn)速固定)及與數(shù)據(jù)采集裝置相連的計算機(jī)，恒溫恒速攪拌2 min后，通過注射器迅速加入0.2 mol·L-1溴酸鉀溶液3 mL，使用電化學(xué)工作站記錄E-t曲線直至電位振蕩消失，得到電化學(xué)指紋圖譜。

2.2 不同濃度硫酸對電化學(xué)指紋圖譜的影響

按照“2.1”項中的方法，溫度控制在37 ℃，在反應(yīng)容器內(nèi)分別加入濃度為1 mol·L-1、2 mol·L-1、3 mol·L-1、4 mol·L-1、5 mol·L-1的硫酸溶液12 mL，其他條件相同，獲得不同的電化學(xué)指紋圖譜，結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)硫酸溶液濃度為1 mol·L-1時，振蕩壽命最短，振幅最小，濃度太低，振蕩規(guī)律不呈變化；隨著硫酸濃度增加，振蕩壽命及振幅先呈增加趨勢，然后又呈降低趨勢，當(dāng)硫酸溶液濃度為3 mol·L-1時，誘導(dǎo)時間最短，振蕩壽命最長，振幅最大，但是該濃度下振蕩反應(yīng)體系耗時不超過2 h，不存在用時過久的問題，綜合考慮下，故選擇硫酸濃度為3 mol·L-1。

圖1 不同濃度硫酸溶液的電化學(xué)指紋圖譜

2.3 不同濃度硫酸鈰銨對電化學(xué)指紋圖譜的影響

按照“2.1”項中的方法，將溫度控制在37 ℃，硫酸溶液、丙二酸溶液、溴酸鉀溶液的體積和濃度不變，在反應(yīng)容器內(nèi)加入濃度分別為3 mmol·L-1、4 mmol·L-1、5 mmol·L-1、6 mmol·L-1、7 mmol·L-1硫酸鈰銨溶液3 mL，得到不同的電化學(xué)指紋圖譜，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著硫酸鈰銨濃度的增加，誘導(dǎo)時間縮短，振蕩壽命變化無規(guī)律，振幅逐漸增大；硫酸鈰銨在B-Z振蕩體系中作為催化劑參與反應(yīng)，不需要配制過高濃度，就可以達(dá)到實(shí)驗效果，硫酸鈰銨溶液是臨用新配，綜合成本考慮，故確定硫酸鈰銨濃度為5 mmol·L-1。

圖2 不同濃度硫酸鈰銨溶液的電化學(xué)指紋圖譜

2.4 不同濃度丙二酸對電化學(xué)指紋圖譜的影響

按照“2.1”項中的方法，將溫度控制在37 ℃，硫酸溶液、硫酸鈰銨溶液、溴酸鉀溶液的體積和濃度不變，在反應(yīng)容器內(nèi)加入濃度分別為0.30 mol·L-1、0.35 mol·L-1、0.40 mol·L-1、0.45 mol·L-1、0.50 mol·L-1丙二酸溶液6 mL，得到不同的電化學(xué)指紋圖譜，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)丙二酸濃度為0.30 mol·L-1時，振幅最大；隨著丙二酸的濃度增加，振蕩時間越來越長，濃度為0.40 mol·L-1時振蕩壽命為3500 s左右，隨后振蕩時間開始縮短，最長耗時1 h左右，丙二酸在B-Z振蕩體系中作為耗散物參與反應(yīng)，結(jié)合誘導(dǎo)時間和振蕩壽命等參數(shù)因素，選擇丙二酸濃度為0.40 mol·L-1。

圖3 不同濃度丙二酸溶液的電化學(xué)指紋圖譜

2.5 不同濃度溴酸鉀對電化學(xué)指紋圖譜的影響

按照“2.1”項中的方法，將溫度控制在37 ℃，硫酸溶液、硫酸鈰銨溶液、丙二酸溶液的體積和濃度不變，最后往反應(yīng)容器里迅速注射濃度分別為0.10 mol·L-1、0.15 mol·L-1、0.20 mol·L-1、025 mol·L-1、0.30 mol·L-1溴酸鉀溶液3 mL，得到不同的電化學(xué)指紋圖譜，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)溴酸鉀濃度為0.30 mol·L-1，，振蕩反應(yīng)開始呈不規(guī)律的趨勢；隨著溴酸鉀濃度增大，最大振幅逐漸增加；溴酸鉀濃度為0.20 mol·L-1時，誘導(dǎo)時間最短，溴酸鉀在常溫下，難溶于水，綜合考慮，選擇溴酸鉀濃度為0.20 mol·L-1。

圖4 不同濃度溴酸鉀溶液的電化學(xué)指紋圖譜

2.6 不同溫度對電化學(xué)指紋圖譜的影響

按照“2.1”項中的方法和已經(jīng)確定的試劑濃度和體積，即3 mol·L-1硫酸溶液12 mL、0.005 mol·L-1硫酸鈰銨溶液3 mL、0.40 mol·L-1丙二酸溶液6 mL和0.20 mol·L-1溴酸鉀溶液3 mL，考察實(shí)驗溫度分別為25 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃時的電化學(xué)指紋圖譜，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著溫度的升高，指紋圖譜特征參數(shù)呈不同規(guī)律變化。當(dāng)溫度為27 ℃時，誘導(dǎo)時間及振蕩壽命最長；隨著溫度的升高，振蕩壽命變短，誘導(dǎo)時間也相應(yīng)減小。振蕩反應(yīng)對溫度很敏感，因此，選擇一個合適的反應(yīng)溫度，對反應(yīng)時間的控制以及圖譜穩(wěn)定性和重復(fù)性具有重要意義。由于人的體溫是36.7～37.7 ℃，陽春砂電化學(xué)指紋圖譜反應(yīng)溫度為37 ℃時接近人體的溫度，且該溫度下振蕩反應(yīng)特征較好，所以實(shí)驗反應(yīng)溫度選擇37 ℃。

圖5 不同溫度下的電化學(xué)指紋圖譜

2.7 不同砂仁粉末加入量對電化學(xué)指紋圖譜的影響

分別取干燥至恒重砂仁粉末(過四號篩)0.00、0.05、0.10、0.15、0.20和0.25 g，按照“2.1”項中的方法和已經(jīng)確定試劑濃度和體積，即3 mol·L-1硫酸溶液12 mL、0.005 mol·L-1硫酸鈰銨溶液3 mL、0.40 mol·L-1丙二酸溶液6 mL和0.20 mol·L-1溴酸鉀溶液3 mL，即可測得電化學(xué)指紋圖譜，結(jié)果見圖6。由圖6可知，當(dāng)振蕩體系中砂粉末加入量為0.00 g時，也可以產(chǎn)生化學(xué)振蕩，另外，在實(shí)驗過程中，可以觀察到溶液從黃色到無色再到黃色的周期性變化過程。隨著加入量的增大，砂仁對振蕩體系抑制作用增強(qiáng)，同時可以觀察到隨著加入量的增大，抑制作用情況增加緩慢；當(dāng)加入量為0.05 g時，從起振電位開始到最高電位，最后到誘導(dǎo)期結(jié)束，其呈現(xiàn)的先增大后減少的趨勢十分不明顯，根據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷，從加入量為0.10 g時，這段趨勢才呈現(xiàn)規(guī)律。綜合考慮分析，反應(yīng)時間過長，需要過長的等待時間，但是又必須保證產(chǎn)生規(guī)律且完整的圖譜。因此，為獲取更好的信息，選擇加入量為0.15 g。

圖6 不同加入量下的電化學(xué)指紋圖譜

2.8 電化學(xué)指紋圖譜的重復(fù)性

取同一砂仁粉末5份，每份0.15 g，精密稱定，根據(jù)“2.1”項中的方法，平行操作5次，測得指紋圖譜的各種指標(biāo)較為相近，RSD均小于2.0%，重復(fù)性良好。結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。

表1 陽春砂電化學(xué)指紋圖譜主要特征參數(shù)

2.9 不同產(chǎn)地砂仁的電化學(xué)指紋圖譜

按“2.1”項中的方法和已經(jīng)確定的最佳反應(yīng)條件，即3 mol·L-1硫酸溶液12 mL、0.005 mol·L-1硫酸鈰銨溶液3 mL、0.40 mol·L-1丙二酸溶液6 mL、0.20 mol·L-1溴酸鉀溶液3 mL、反應(yīng)溫度37 ℃、加入量0.15 g，進(jìn)行不同產(chǎn)地，即分別為陽春、福建、廣西、湛江、海南、云南這6個產(chǎn)地電化學(xué)指紋圖譜的測定，結(jié)果見圖7和表2。

圖7 不同產(chǎn)地的砂仁電化學(xué)指紋圖譜

表2 不同產(chǎn)地的砂仁電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)

由圖7可知，不同產(chǎn)地的砂仁指紋圖譜存在差距；由表2可知，振蕩壽命、最高電位等特征參數(shù)的定量信息均有差異。因此，選擇不同產(chǎn)地的砂仁參加振蕩反應(yīng)，會產(chǎn)生不同的電化學(xué)指紋圖譜。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗利用封閉體系中以丙二酸作為耗散物的B-Z振蕩體系對砂仁電化學(xué)指紋圖譜進(jìn)行研。得到最實(shí)驗條件為硫酸濃度3 mol·L-1、硫酸鈰銨濃度0.005 mol·L-1、丙二酸濃度0.40 mol·L-1、溴酸鉀濃度0.2 mol·L-1、反應(yīng)溫度37 ℃、藥材加入量0.15 g。重復(fù)性實(shí)驗表明電化學(xué)指紋圖譜具有良好的重復(fù)性。同時，研究結(jié)果也表明，電化學(xué)指紋圖譜能夠全面反映中藥材的內(nèi)在質(zhì)量，含有豐富的定性定量信息，且具有直觀、特征性強(qiáng)和操作簡單等特點(diǎn)。電化學(xué)指紋圖譜是對中藥材中所有化學(xué)成分的化學(xué)振蕩體現(xiàn)，不同產(chǎn)地的砂仁因為生長環(huán)境及氣候等因素影響，所含化學(xué)成分存在差異。因而可以用電化學(xué)指紋圖譜方法進(jìn)行鑒別不同產(chǎn)地的砂仁。