郝晶晶，張府君，藥雅俊，甄會(huì)賢

(山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030031)

粉葛為豆科植物甘葛藤PuerariathomsoniiBenth.的干燥根。在秋、冬季采挖后，去除外皮，稍干，截?cái)嗷蛟偾谐珊衿稍铮吹肹1]。粉葛，性涼，味甘、辛，具有解肌退熱，發(fā)表透疹，生津止渴，升陽(yáng)止瀉等功效[2]，主要用于治療外感發(fā)熱，項(xiàng)背強(qiáng)痛，麻疹初起，疹出不暢等病證[3]。其有效成分主要為黃酮類(lèi)化合物，包括大豆苷、葛根素等[4]。中藥配方顆粒，又稱(chēng)為免煎顆粒，作為傳統(tǒng)中藥飲片的補(bǔ)充，是對(duì)傳統(tǒng)湯劑的改革。它是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，利用現(xiàn)代科技手段，以單味中藥飲片為原料，經(jīng)過(guò)提取、濃縮、制粒等制成的供臨床調(diào)劑使用的粉狀或顆粒狀產(chǎn)品。中藥配方顆粒具有劑量準(zhǔn)確、衛(wèi)生、免煎易服和貯存攜帶方便等特點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)中藥飲片煎煮過(guò)程繁瑣、攜帶服用不方便等不足[5-6]。本實(shí)驗(yàn)采用TLC對(duì)粉葛配方顆粒進(jìn)行鑒別，采用HPLC建立含量測(cè)定以及指紋圖譜方法，為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2998檢測(cè)器，Empower色譜工作站；CP214型電子分析天平(萬(wàn)分之一)，奧豪斯儀器有限公司；AB135-S電子天平(十萬(wàn)分之一)，瑞士METTLER公司；ZF-90型暗箱式紫外透射儀，上海顧村電光儀器廠；Diamonsil C18(2)(4.6 mm×200 mm，5 μm)色譜柱；硅膠G板(批號(hào)：20150302)，青島海洋化工廠分廠。

1.2 試 藥

粉葛(豆科植物甘葛藤的干燥根，批號(hào)：110725-201615)，購(gòu)自河北全泰藥業(yè)有限公司，由甄會(huì)賢副教授鑒定為正品；10批不同產(chǎn)地粉葛飲片(1.產(chǎn)地：天津，批號(hào)：2017051140；2.產(chǎn)地：安徽，批號(hào)：2016110591；3.產(chǎn)地：廣西，批號(hào)：2016060161；4.產(chǎn)地：廣西，批號(hào)：161201；5.產(chǎn)地：廣東，批號(hào)：160802；6.產(chǎn)地：廣東；批號(hào)：1607018；7.產(chǎn)地：云南，批號(hào)：6-1-1939；8.產(chǎn)地：河北，商鋪號(hào)：安國(guó)；9.產(chǎn)地：四川，批號(hào)：6-1-1952；10.產(chǎn)地：天津，批號(hào)：110725-201615)；葛根素對(duì)照品(批號(hào)：110752-201615)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純，批號(hào)：20170301)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。其余試劑為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 配方顆粒的制備

稱(chēng)取粉葛飲片，加水煎煮2次，每次1 h(第一次加水量10倍，浸泡30 min，第二次加水量8倍)，合并煎液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1 mL藥液相當(dāng)于原藥材1.5 g(相對(duì)密度1.07，60 ℃)。噴霧干燥得到的干燥藥粉加入麥芽糊精適量(干燥藥粉量的0.5倍)，混勻，干法制粒，即得。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備

取本品粉末0.27 g，精密稱(chēng)定，加甲醇10 mL，放置2 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取葛根素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 薄層色譜鑒別

照薄層色譜法(通則0502)實(shí)驗(yàn)，吸取供試品溶液5 μL、葛根素對(duì)照品1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水(10:2:0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)后取出，晾干，置紫外儀(365 nm)下檢視。

2.2.4 薄層結(jié)果

供試品薄層色譜中，在與對(duì)照品葛根素相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點(diǎn)(見(jiàn)圖1)。

圖1 粉葛配方顆粒薄層色譜圖

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備

取葛根素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加30%乙醇制成每1 mL含0.32 mg的溶液，作為母液。

2.3.2 供試品溶液的制備

取本品粉末約0.27 g，參照文獻(xiàn)[3]制備供試品溶液。

2.3.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(2)(4.6 mm×200 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-水(25:75)；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫：30 ℃，理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于4000，分離度良好(見(jiàn)圖2)。

圖2 粉葛配方顆粒含量測(cè)定HPLC色譜圖

2.3.4 線(xiàn)性關(guān)系的考察

精密吸取葛根素對(duì)照品母液0.0625 mL、0.125 mL、0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL各于2 mL容量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，搖勻。精密吸取每份樣品10 μL按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定葛根素的線(xiàn)性關(guān)系。以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，作圖。結(jié)果見(jiàn)圖3以及表1。

表1 線(xiàn)性關(guān)系考察實(shí)驗(yàn)

圖3 葛根素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

回歸方程為：y=1827793.78x+5088.46，r=0.9996，表明葛根素在0.1～1.6 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

表2 葛根素精密度實(shí)驗(yàn)

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試品溶液在0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD值，見(jiàn)表3，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 葛根素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批粉葛配方顆粒共6份，每份約0.27 g，研細(xì)，精密稱(chēng)定，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備得供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定葛根素峰面積，計(jì)算葛根素的含量，計(jì)算RSD值，結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

表4 葛根素重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取已知含量的粉葛配方顆粒六份，每份0.14 g，按樣品中葛根素含量與對(duì)照品(1:1)加入一定量的葛根素對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，計(jì)算葛根素的加樣回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表5，結(jié)果表明建立的方法準(zhǔn)確度良好。

表5 樣品中葛根素回收率實(shí)驗(yàn)

2.3.9 樣品含量測(cè)定

分別精密吸取10批不同產(chǎn)地的粉葛制備的配方顆粒供試品溶液各10 μL，按“2.3.3”項(xiàng)下條件注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品中葛根素含量測(cè)定結(jié)果

由表6結(jié)果可知粉葛配方顆粒中葛根素為11.44 mg/g，在此基礎(chǔ)上下浮20%設(shè)限，由此確定本品每g含粉葛以葛根素(C21H20O9)計(jì)，不得少于9.15 mg。

2.4 粉葛配方顆粒指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)方法

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(2)(4.6 mm×200 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水，流動(dòng)相洗脫條件見(jiàn)表7；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL；參照物分離度良好，7個(gè)峰重現(xiàn)性好(見(jiàn)圖4)。

表7 流動(dòng)相洗脫條件

圖4 粉葛配方顆粒指紋圖譜

2.4.2 供試品溶液的制備

按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備。

2.4.3 參照物溶液的制備

取葛根素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加30%乙醇制成每1 mL含80 μg的參照物溶液。

2.4.4 指紋圖譜的建立

采用藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，設(shè)定S5為參照?qǐng)D譜，將其他樣品的色譜峰與參照峰進(jìn)行自動(dòng)匹配生成粉葛指紋圖譜疊加圖圖5所示。

圖5 10批粉葛顆粒指紋圖譜(S5 參照?qǐng)D譜；R對(duì)照?qǐng)D譜)

2.4.5 指紋圖譜相似度計(jì)算

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》進(jìn)行相似度計(jì)算，將10批粉葛配方顆粒數(shù)據(jù)導(dǎo)入系統(tǒng)，設(shè)定中位數(shù)匹配模式，進(jìn)行色譜峰匹配，并進(jìn)行相似度分析，利用夾角余弦法對(duì)樣品進(jìn)行相似度計(jì)算(見(jiàn)表8)。通過(guò)計(jì)算得到10批粉葛配方顆粒的色譜指紋圖譜與共有模式的色譜指紋圖譜的相似度，以此來(lái)評(píng)價(jià)這10批粉葛藥材的質(zhì)量。

表8 相似度計(jì)算結(jié)果

根據(jù)相似度計(jì)算結(jié)果可以得知，與對(duì)照指紋圖譜相比較，10批粉葛藥材相似度均>0.90，具有較好相似性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)初期采用2015版《中國(guó)藥典》粉葛鑒別項(xiàng)下的展開(kāi)系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行薄層色譜鑒別，即二氯甲烷-甲醇-水(7:2.5:0.25)，效果不理想。調(diào)整展開(kāi)系統(tǒng)為二氯甲烷-甲醇-水(10:2:0.2)后，展開(kāi)效果好，斑點(diǎn)清晰，此方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，可作為粉葛定性鑒別方法。

中藥指紋圖譜能較全面地反映中藥中所含化學(xué)成分的組成及含量分布情況，進(jìn)而對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)[7-8]，使質(zhì)量控制指標(biāo)由單一成分含量測(cè)定上升為對(duì)整個(gè)中藥內(nèi)在品質(zhì)的檢測(cè)[9-10]，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和整體物質(zhì)的全面控制。結(jié)果顯示，10批粉葛配方顆粒的指紋圖譜中色譜峰數(shù)目一致，含量相近，不同批次間差異小，證明其制備工藝穩(wěn)定。由此可知，本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相指紋圖譜特征性強(qiáng)，結(jié)合葛根素的含量測(cè)定，可作為控制粉葛配方顆粒的質(zhì)量控制方法，使質(zhì)量達(dá)到穩(wěn)定可控。