廖藝鈺，惠呂佳，嚴(yán)吉祥，計(jì)偉佳，陳夏偉，楊華云

(杭州師范大學(xué)錢(qián)江學(xué)院，浙江 杭州 310018)

隨著社會(huì)現(xiàn)代化的不斷發(fā)展，各種污染物大量地進(jìn)入水體環(huán)境，農(nóng)藥作為一種十分常見(jiàn)的污染物，是水域安全評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。作為有機(jī)氯農(nóng)藥的替代品，有機(jī)磷農(nóng)藥在我國(guó)使用量非常大。該類(lèi)農(nóng)藥是一類(lèi)高效經(jīng)濟(jì)的常用殺蟲(chóng)殺螨劑，但其利用率非常低，約在20%左右，剩下的80%則全部進(jìn)入環(huán)境中。經(jīng)過(guò)生物富集與食物鏈的傳遞和逐級(jí)濃縮、放大等作用，有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)生物和人類(lèi)的健康以及環(huán)境造成很大的危害。通過(guò)河流、大氣工業(yè)排放等方式，有機(jī)磷農(nóng)藥一般最終將匯入海洋，因此海洋成為了有機(jī)磷的最終歸宿。然而，大多數(shù)海洋生物對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥十分敏感，因此引發(fā)大量的魚(yú)、蝦、貝等的大量死亡，危及了非靶生物的生存，導(dǎo)致海洋動(dòng)物數(shù)量劇減，甚至滅絕，威脅到海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。草甘膦對(duì)人和土壤生物等均有不同程度的毒性，但目前關(guān)于這種除草劑對(duì)水生態(tài)危害的報(bào)道較少，研究斑馬魚(yú)對(duì)這種除草劑的響應(yīng)，旨在引起人們關(guān)注水生態(tài)中除草劑的安全問(wèn)題，并為其合理施用提供科學(xué)依據(jù)。本文以斑馬魚(yú)作為模式生物，研究有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性以及慢性毒性的影響，以期得到有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)的毒性效應(yīng)，為保障居民身體健康以及環(huán)境保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

作為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織推薦的實(shí)驗(yàn)魚(yú)種，斑馬魚(yú)購(gòu)于杭州某花鳥(niǎo)市場(chǎng)，平均體長(zhǎng)1～2.5 cm，體重100～400 mg。草甘膦農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，實(shí)驗(yàn)時(shí)需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

(1)斑馬魚(yú)預(yù)先購(gòu)買(mǎi)放置在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)馴養(yǎng)7 d，每24 h喂食一次，實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室蒸餾水，目的是排除氯離子的干擾，并同時(shí)使用增氧泵，保證溶解氧≥5.0 mg/L，試驗(yàn)用水溫度控制在(25±1)℃，試驗(yàn)前兩天停止喂食。

(2)經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定各實(shí)驗(yàn)藥物的質(zhì)量濃度范圍(96 h全活質(zhì)量濃度上限和96 h全致死質(zhì)量濃度下限)后，在室溫條件下，在長(zhǎng)寬高為20×17×15(cm)的魚(yú)缸中，按一定的間距設(shè)置不同的濃度梯度組，試驗(yàn)共五組，一組空白對(duì)照組，采用靜態(tài)實(shí)驗(yàn)法，開(kāi)展單一有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度梯度放置10尾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，各魚(yú)缸中溶液的體積均為2 L，連續(xù)觀(guān)察受試對(duì)象的活動(dòng)狀態(tài)，以用鑷子觸碰魚(yú)頭部5 s以上完全無(wú)反應(yīng)作為死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)，及時(shí)取出死亡個(gè)體，分別記錄24 h，48 h，72 h，96 h的死亡數(shù)量，計(jì)算一次的總體平均死亡率。

(3)數(shù)據(jù)處理

采用寇氏法[2]計(jì)算斑馬魚(yú)的半致死濃度LC50：

LogLC50=Xm-d(∑P-0.5)

安全質(zhì)量濃度SC按以下公式計(jì)算：

SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

1.2.2 慢性毒性實(shí)驗(yàn)

(1)斑馬魚(yú)的馴養(yǎng)過(guò)程和急性毒性實(shí)驗(yàn)的馴養(yǎng)過(guò)程相同，試驗(yàn)前兩天停止喂食，根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)置5個(gè)不同濃度梯度的實(shí)驗(yàn)組，一個(gè)空白對(duì)照組，每個(gè)濃度梯度放置10尾魚(yú)。采用靜態(tài)實(shí)驗(yàn)法，分別于1 d，7 d，14 d后采集樣本。

(2)酶的測(cè)定

分別在7 d、14 d時(shí)，在每缸中取5尾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在冰塊上冰麻后稱(chēng)量其體重，放入勻漿管中，再按照體重49倍加入生理鹽水進(jìn)行勻漿，充分研碎，使組織勻漿化。將配制好的勻漿用離心機(jī)1500 r/min進(jìn)行離心10 min，離心后取上清液放入1 cm光徑比色皿，于412 nm處使用分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度，空白管用來(lái)調(diào)零，測(cè)各管的吸光度。同標(biāo)準(zhǔn)乙酰膽堿酯酶溶液對(duì)比后并計(jì)算酶活。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制

精確量取乙酰膽堿酯酶的標(biāo)準(zhǔn)液，分別制得0、0.2、0.4、0.6、1 ppm的酶溶液，以酶濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y = 0.3599x-0.0046，相關(guān)系數(shù)R2=0.9967。實(shí)驗(yàn)以此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為準(zhǔn)。

圖1 乙酰膽堿酯酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

(4)數(shù)據(jù)處理

酶活計(jì)算公式：

式中：ΔA412為反應(yīng)前后吸光度的差值；V為反應(yīng)體系總體積；ε為產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)；T為反應(yīng)時(shí)間；d為比色皿寬。

2 結(jié)果與討論

2.1 斑馬魚(yú)急性毒性實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果

草甘膦對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：草甘膦濃度達(dá)到2.0 mg/gL以上時(shí)，24 h內(nèi)試驗(yàn)魚(yú)全部死亡；草甘膦的濃度達(dá)到3.0 mg/gL時(shí)，2 h內(nèi)個(gè)別魚(yú)開(kāi)始出現(xiàn)側(cè)翻，身體不平衡的現(xiàn)象，8 h后在底部掙扎，嚴(yán)重失衡，12 h內(nèi)全部死亡。隨著時(shí)間的推移，各個(gè)濃度的魚(yú)都有出現(xiàn)個(gè)別死亡。草甘膦對(duì)斑馬魚(yú)的毒性比較強(qiáng)，斑馬魚(yú)剛開(kāi)始出現(xiàn)急躥現(xiàn)象，而且伴有集群現(xiàn)象，但很快就消失，稍后魚(yú)群都聚集在水底。隨著中毒程度的加深，魚(yú)出現(xiàn)了身體不平衡、顫抖或者游動(dòng)緩慢，身體開(kāi)始立于水中，出現(xiàn)了反應(yīng)遲鈍，張口喘氣等中毒現(xiàn)象，最后鰓部充血死亡，腹部朝上浮在水面上，或者以側(cè)躺的姿勢(shì)沉在水底。濃度高的組別從開(kāi)始試驗(yàn)、中毒到死亡時(shí)間更短，中毒效果也更加明顯。

2.2 斑馬魚(yú)對(duì)草甘膦急性毒性的LD50和安全濃度的評(píng)價(jià)

斑馬魚(yú)對(duì)草甘膦急性毒性的半致死濃度和安全濃度如表1所示。根據(jù)國(guó)家環(huán)保局發(fā)布的毒性分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[3]，急性毒性96h LC50<0.1 mg/L為劇毒，0.1～1.0 mg/L為高毒，1.0～10.0 mg/L為中毒，>10.0 mg/L為低毒。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，草甘膦的96h LC50為0.879 ppm，屬于高毒農(nóng)藥。草甘膦是目前使用最廣泛、用量最大的除草劑種類(lèi)之一，如此高毒性農(nóng)藥的大量使用并在環(huán)境中大量殘留會(huì)給環(huán)境帶來(lái)了巨大的潛在風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明近年其主要用于治理河塘、湖泊中的水生雜草，在水中的殘留會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)的生存產(chǎn)生較大的危害[4]。

表1 草甘膦對(duì)斑馬魚(yú)的LD50和SC

2.3 斑馬魚(yú)對(duì)草甘膦慢性毒性試驗(yàn)的結(jié)果

有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶酶活性的影響見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，隨著時(shí)間的推遲，乙酰膽堿酯酶的酶活會(huì)持續(xù)降低且濃度越高，乙酰膽堿酯酶的酶活越低。但隨著時(shí)間的無(wú)限延長(zhǎng)，乙酰膽堿酯酶的酶活下降幅度會(huì)逐漸減少，并穩(wěn)定在一個(gè)確定值范圍內(nèi)，直至生物體死亡。高濃度有機(jī)磷農(nóng)藥的使用將使得水生生物出現(xiàn)大批量的死亡現(xiàn)象，即使?jié)舛容^低，毒素也會(huì)在生物體內(nèi)滯留，并影響其正常新陳代謝，經(jīng)過(guò)生物放大作用，甚至影響人類(lèi)健康，但同時(shí)經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)研究以及對(duì)文獻(xiàn)的分析，發(fā)現(xiàn)如今水生生物已經(jīng)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥出現(xiàn)了抗性，且不同水域的抗性不盡相同[5-6]。Modesto等[7]研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦制農(nóng)藥能對(duì)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生毒害作用，具體表現(xiàn)為：血液中的血球容積增大，體內(nèi)的抗氧化酶活性改變，紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量增加。Lajmanovich等[8]報(bào)道，草甘膦對(duì)水生動(dòng)物魚(yú)、蝦、青蛙、蝌蚪等產(chǎn)生毒害，草甘膦農(nóng)藥在施藥48 h后降低青蛙體內(nèi)乙酰膽堿脂酶和谷胱甘肽酶活性，且3.80 mg/L草甘膦可使蝌蚪大量死亡。劉曉偉等[9]也研究表明，低濃度的草甘膦對(duì)多刺裸腹溞具有毒性，LC50(48 h)=26.29 mg/L。

圖2 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶酶活性的影響

3 結(jié) 論

我國(guó)是產(chǎn)糧、用糧大國(guó)，農(nóng)藥的使用問(wèn)題一直以來(lái)都是國(guó)民關(guān)心的重要問(wèn)題。而農(nóng)藥本身的安全性與使用上的科學(xué)性的提升是對(duì)我國(guó)現(xiàn)階段的發(fā)展來(lái)說(shuō)至關(guān)重要的因素。本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚(yú)為模式生物，嘗試性地探究有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥草甘膦在斑馬魚(yú)身上的急性與慢性毒性效應(yīng)。急性毒性結(jié)果表明，草甘膦屬于高毒農(nóng)藥，其96 h LC50為0.879 mg/L；慢性毒性表明，草甘膦農(nóng)藥會(huì)顯著得抑制乙酰膽堿酯酶的活性。那么對(duì)于草甘膦農(nóng)藥的使用，給出以下建議：在進(jìn)行農(nóng)藥施藥時(shí)，不要逆風(fēng)和在大風(fēng)天以及高溫時(shí)段噴藥，在保證農(nóng)藥適用范圍之外，減少農(nóng)藥的污染面積，以及高溫?fù)]發(fā)對(duì)空氣的污染，特別是環(huán)湖邊的農(nóng)田尤其不要再大風(fēng)時(shí)候施藥。同時(shí)應(yīng)該嚴(yán)格控制農(nóng)田中高農(nóng)藥的使用情況以及在使用過(guò)程中時(shí)刻觀(guān)察附近生物的活動(dòng)情況。