陳海燕，張 娟，鄒麗君

（贛南醫(yī)學院預防醫(yī)學系，江西 贛州341000）

苯是一種易揮發(fā)性有機化合物，廣泛存在于各種裝修材料、日用化學品的使用中，是造成室內(nèi)空氣污染的主要成分，也是某些職業(yè)人群面臨的主要的職業(yè)污染物［1］?？諝庵斜降暮可仙秊橐欢舛葧r，可使機體出現(xiàn)頭痛、惡心、嘔吐、四肢乏力等急性中毒表現(xiàn)，而長期吸入可造成慢性中毒，對人體的各大臟器產(chǎn)生嚴重損害，特別是血液系統(tǒng)方面，重者可引起白血病等惡性疾病的發(fā)生［2］。國際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）已明確將苯列為人類的Ⅰ類致癌劑［3］，同時具有遺傳毒性。而關于其具體作用機制，尚未完全闡明，有研究認為其與脂質(zhì)過氧化等多種因素有關［4］。因此，學者們在探究苯中毒的職業(yè)保護措施外，亦不斷致力于如何減輕苯中毒者的毒性作用［5］。橙子為一種熱帶、亞熱帶蕓香科橙子亞科的果實。香精油是橙皮中提取的主要成分之一，占柑橘皮總重的0.5%～2%，以萜烯類、D-檸檬烯、倍半萜烯類、高級醇類、醛類、酮類、酯類等組成的含氧化合物為主要成分［6］，在食品及化妝品行業(yè)應用廣泛。柑橘香精油具有多種功效，如消炎抑菌、抗氧化、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)、減輕應激等［6-7］。近年來亦有研究發(fā)現(xiàn)，較多植物精油具有分解致癌物質(zhì)的有毒官能團，抑制癌變細胞新陳代謝的作用［8］。而橙皮精油是否對苯所致的毒性作用具有保護作用，仍未見相關報道，因此本文旨在研究橙皮精油對苯染毒小鼠的保護作用，期望為探索苯染毒的保護措施提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑選取30只清潔級健康ICR小鼠，4～5周齡，雌雄各半，體重20～30 g。由贛南醫(yī)學院黃金校區(qū)實驗動物中心提供，許可證號為：SYXK（贛）：2007-2002。小鼠適應性喂養(yǎng)一周，飲水禁食自由，飼養(yǎng)條件為：自由采光，室溫調(diào)節(jié)在20℃～25℃，濕度為50%～75%。本實驗所用橙皮精油購自江西恒誠天然香油有限公司，密度為840 mg·mL-1；苯液（密度為880 mg·mL-1，分析純）、乙醇（分析純）

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差（-x±s）表示，三組小均購自山東德彥化工有限公司。本實驗方案經(jīng)本院倫理委員會批準，實驗過程符合動物福利及相關法規(guī)、標準和指南要求。

1.2 動物染毒將30只小鼠隨機分為對照組、苯染毒組和苯+精油組，雌雄各半共10只。其中，苯染毒組以200 mg·kg-1體重的劑量進行苯灌胃染毒，苯+精油組則灌胃給予苯+精油的混合溶液，對照組給予等量的乙醇溶液。均染毒30 d。其中，橙皮精油經(jīng)稀釋16.8倍，以595μL溶于10 mL乙醇中制作而成；苯液的配置方法為將其稀釋44倍，以227μL溶于10 mL乙醇中；苯+精油混合液的配制為取595μL精油和227μL的苯混合溶于20 mL乙醇中。

1.3 觀察指標與實驗方法

1.3.1 一般情況染毒初及染毒期間每隔1周稱重1次，記錄其體重情況，并觀察小鼠活動量、皮毛、進食量等的一般狀態(tài)。

1.3.2 血常規(guī)指標末次染毒后禁食12 h，稱重后麻醉大鼠，由內(nèi)眥動脈取血2 mL，膠體抗凝劑抗凝，采用邁瑞B(yǎng)C-3300全自動血細胞分析儀（武漢科爾達醫(yī)療科技有限公司）進行血常規(guī)的檢測，比較三組的紅細胞計數(shù)（RBC）、白細胞計數(shù)（WBC）、血紅蛋白（HGB）和血小板（PLT）的差異。

1.3.3 臟器系數(shù)解剖小鼠，打開腹腔取其心、肝、腎、脾、睪丸、卵巢、子宮等臟器，生理鹽水洗凈、濾紙吸干后稱重，計算各臟器的臟器系數(shù)，其計算公式為：臟器系數(shù)（%）=臟器重量（g）/體重（g）×100。凍存于-80℃的冰箱中。

1.3.4 抗氧化指標SOD、MDA水平取小鼠血樣3～4滴（促凝）及適量肝組織（冰浴下勻漿），3 500 r·min-1于4℃低溫離心機中離心10 min，取上清液保存于4℃冰箱內(nèi)。統(tǒng)一采用南京建成生物工程研究所的SOD測試盒（酶標法）和MDA測試盒（酶標法）對三組血清和肝組織中的SOD、MDA的含量進行測定。

1.3.5 組織病理學檢測取適量肝臟組織，浸入10%的甲醛溶液中保存、固定，經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋等處理后，切片機切成厚度為5μm左右薄片，HE染色，在光鏡下觀察其形態(tài)學改變。鼠的體重比較采用重復測量資料的方差分析，其余指標比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey方法。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 一般情況喂養(yǎng)28 d內(nèi)，對照組小鼠的體重呈持續(xù)緩慢增長，活動及精神狀態(tài)良好，皮毛正常（P＞0.05）；苯染毒組小鼠體重下降明顯（P＜0.05），呈現(xiàn)煩躁等表現(xiàn)，精神狀態(tài)不佳，皮毛無光澤；苯+精油組體重較為平穩(wěn)、略有下降（P＞0.05），煩躁表現(xiàn)減輕，精神尚可。三組小鼠在喂養(yǎng)第28 d前的體重對比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而28 d后的體重比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其體重變化情況見表1、圖1。

表1三組小鼠的體重變化情況/g，-x±s

圖1三組小鼠的體重變化情況

2.2 臟器系數(shù)對比三組小鼠的心臟、腎臟的臟器系數(shù)相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而在肝臟、脾臟和肺的臟器系數(shù)方面，苯染毒組＞苯+精油組＞對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 肝臟組織病理學變化對照組小鼠肝小葉結構清晰，中央靜脈位于小葉中部，肝細胞形態(tài)未見異常，索竇比例正常，匯管區(qū)未見纖維組織增生、腫脹變性。而苯染毒組表現(xiàn)為明顯的肝細胞壞死，呈現(xiàn)為胞漿疏松、體積變大、細胞腫脹，細胞核裂解、溶解，細胞膜不完整等，嚴重者氣球樣變，還可見脂肪變性，出現(xiàn)氣泡；苯+精油組亦呈現(xiàn)輕微肝細胞壞死現(xiàn)象，但較苯染毒組明顯減輕。見圖2。

表2三組小鼠臟器系數(shù)對比/±s

表2三組小鼠臟器系數(shù)對比/±s

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2.4 三組小鼠血常規(guī)指標苯染毒組和苯+精油組小鼠的RBC、HGB和PLT均較對照組降低，且苯染毒組低于苯+精油組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而三組的WBC比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.5 三組抗氧化指標苯染毒組和苯+精油組小鼠的血、肝SOD水平均較對照組降低，且苯染毒組低于苯+精油組；而血和肝MDA水平均高于對照組，且苯染毒組高于苯+精油組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

圖2三組小鼠的肝組織病理切片觀察（HE染色，×200倍）

表3三組小鼠血常規(guī)指標對比/±s

表3三組小鼠血常規(guī)指標對比/±s

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表4三組小鼠抗氧化指標對比/±s

表4三組小鼠抗氧化指標對比/±s

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3 討論

苯為一種無色透明的芳香烴類化合物，極易揮發(fā)，在空氣中主要以蒸汽形式存在，并可通過呼吸道、皮膚和消化道等多種途徑進入體內(nèi)。目前已知苯是人類的強致癌物之一，可致多器官和系統(tǒng)的慢性毒作用，但造血系統(tǒng)為苯中毒的主要靶標，所致?lián)p害最為突出，表現(xiàn)為紅細胞、血小板和白細胞數(shù)量的進行性降低，進而可能發(fā)生再生障礙性貧血、白血病等惡性腫瘤［9］。然而對于苯暴露所致的造血毒性的機制尚未明確，研究主要認為與基因易感性、相關蛋白的損傷、表觀遺傳學改變、氧化應激及DNA損傷等機制有關［10］。

近年來學者們在致力于苯染毒的作用機制研究外，如何減輕或消除苯中毒的不良效應及其相關的分子機制亦成為研究的重要課題［11-12］。橙皮精油是具有抑菌、鎮(zhèn)靜、抗氧化、抑制癌細胞新陳代謝等多種活性的天然物質(zhì)，隨著橙皮加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其各種潛在價值亦不斷受到重視，從而增加了產(chǎn)品的附加值［13］。因此，本研究采用橙皮精油干預苯慢性低劑量中毒小鼠，從血液學指標、氧化損傷和DNA損傷等方面，觀察其在干預過程中的效果，旨在為探索苯中毒的發(fā)生機制和保護措施提供參考。

動物的體重和臟器系數(shù)是毒理學實驗中反映慢性和亞慢性毒性的兩種較靈敏指標，可較好地反映實驗動物受毒害的程度，及大體估計其內(nèi)臟器官病變的性質(zhì)和程度。本研究結果發(fā)現(xiàn)，苯染毒組小鼠的體重及肝、脾、肺等器官的臟器系數(shù)均較對照組顯著下降，而苯+精油組均高于苯染毒組；三組肝組織病理學變化亦顯示，苯染毒造成了小鼠肝組織細胞的壞死，精油干預后肝細胞壞死現(xiàn)象更為輕微。說明苯對小鼠的身體機能及內(nèi)臟器官造成了一定程度的損害，引起了臟器的萎縮，橙皮精油可對這種損傷產(chǎn)生一定的保護作用。

血象分析是苯接觸的效應生物標志，檢測方法方便迅速，為當前苯接觸人群的最常用監(jiān)測指標［14］。有研究表明［15］，苯在機體內(nèi)經(jīng)代謝活化在骨髓中被轉(zhuǎn)化為終致癌物苯醌，可破壞骨髓的造血干、祖細胞及造血微環(huán)境，從而引起造血細胞的更新與分化異常，產(chǎn)生造血毒性。丁婷婷［16］的研究結果顯示，低、中、高濃度的亞慢性苯染毒均可導致小鼠的血液系統(tǒng)損傷，表現(xiàn)為白細胞、紅細胞和淋巴細胞計數(shù)的降低。但低濃度苯暴露對人群是否存在血液毒性卻具有一定的爭議［17］。本次研究采用低劑量苯進行灌胃染毒，觀察其亞慢性毒性作用，結果發(fā)現(xiàn)，在血液學指標方面，苯染毒組和苯+精油組小鼠血液中的RBC、HGB和PLT均低于對照組，而苯+精油組高于苯染毒組（P＜0.05）。提示低劑量苯染毒可對小鼠的血液系統(tǒng)產(chǎn)生損傷，橙皮精油可有效改善其造成的損傷程度。分析其原因，可能與橙皮精油可降解苯的一些代謝毒產(chǎn)物，從而降低其相關損害作用有關［18］。

本次研究亦發(fā)現(xiàn)，在氧化指標方面，苯染毒組和苯+精油組小鼠的血、肝SOD水平均較對照組降低，且苯染毒組低于苯+精油組；而血和肝MDA水平均高于對照組，且苯染毒組高于苯+精油組（P＜0.05）。說明苯低劑量亞慢性染毒可對小鼠的血液系統(tǒng)和肝臟造成氧化性損傷，而橙皮精油可通過增強內(nèi)源性抗氧化酶的活力，從而減輕其造成的氧化性損傷。究其原因，可能與橙皮精油具有較強的抗氧化作用有關。這與以往的研究結果具有一致性，如黃娜娜等［19］采用體外抗氧化測試方法研究柑橘精油的抗氧化作用發(fā)現(xiàn)，橙皮精油中含有萜烯化合物和Lγ-松油烯等活性成分，可顯著降低提高DPPH自由基的清除率，降低成纖維細胞氧化損傷模型的MDA含量，并改善其抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT的活力。筆者［20］在前期研究中亦有證實，橙皮精油具有較強的DPPH自由基清除效果，對花生油的抗氧化作用較強。

綜上所述，低劑量亞慢性苯染毒可對小鼠的血液系統(tǒng)和抗氧化指標造成損傷作用，橙皮精油可發(fā)揮顯著的改善作用。