王淑珍，周歷萍，裘劼人，童建新，余 紅，柴偉國，來文國

(杭州市農業(yè)科學研究院 生物技術研究所，浙江 杭州 310024)

草莓屬(Fragaria)約有25個種，分屬2x、4x、5x、6x、8x、10x等不同倍性。我國是世界上野生草莓資源最豐富的國家，分布有14個種，包括9個二倍體種和5個四倍體種[1-2]，分布著極有價值的珍貴類型，如白果類型、抗病類型(黃毛草莓F.nilgerrensis、五葉草莓F.pentaphylla)、芳香類型、抗寒類型(東北草莓F.mandschurica、東方草莓F.orientalis)等[1]。低倍性野生草莓資源具有抗病、抗逆、高芳香性，同時在高固形物含量、高鈣鉀鐵元素含量和高氨基酸含量等方面也有較高的利用價值。野生草莓資源的利用是草莓新品種改良的潛力所在，是栽培品種改良的重要遺傳資源[2-4]。目前生產上廣泛栽培的主要是八倍體鳳梨草莓(F.×ananassaDUCH.)。系譜和遺傳多樣性分析表明，草莓種內品種間雜交使栽培品種遺傳背景狹窄，抗病性和抗逆性減弱[3]。國內外學者通過草莓種間雜交獲得了具有潛在利用價值的種間雜交后代材料[1，3，5-7]，例如雷家軍等[1]用栽培品種哈尼(8x)和自然野生草莓黑龍江1號(5x)雜交，獲得了種間雜種HH-1(6x)；用湯姬(8x)和黑龍江7號(5x)得到了9x種間雜種[6]、十二倍體種間雜種YH15-10[7]等。這些種間雜交材料的獲得可將野生草莓資源中的優(yōu)良性狀基因向栽培品種轉移，豐富了優(yōu)良草莓新品種選育的材料基礎。本研究利用現(xiàn)有8x栽培種鳳梨草莓資源與2x野生草莓資源進行種間雜交，通過對種間雜交后代和父母本的性狀比較研究，評價和進一步利用種間雜種后代，創(chuàng)制豐富的優(yōu)良育種材料，獲得基因漸滲系。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：2x森林草莓Ruegen (RG)、8x栽培品種紅玉(Hongyu)，RG×紅玉的種間雜交后代6x RH28。材料來源于杭州市農業(yè)科學研究院。

1.2 方法

前期試驗結果表明，田間自然條件下RG僅在小蕾期有少量具活力的花藥，其余各階段均未檢測到花藥活力，雌蕊柱頭在大蕾期、開花第1天、開花第2天、開花第3天具弱可授性，其他花期柱頭均不具可授性[2]。種間雜交于2017年2月下旬進行，RG×紅玉正反交二組雜交組合，每組合雜交100朵花，同時對2個母本去雄10朵花套袋作為對照，觀察去雄效果。雜交果實正常成熟時調查雜交結實率。采集雜交種子于當年5月下旬播種于苗床，當幼苗展開3片真葉時移栽于營養(yǎng)缽，于控溫控濕玻璃大棚中培養(yǎng)，統(tǒng)計實生苗出苗率，并進行染色體倍性檢測。2017年9月定植于栽培大棚，田間觀察于2017年9月至2018年5月進行。

1.3 染色體數檢測

1.3.1 根尖染色體數測定

采用1 mol·L-1HCl解離10 min，卡寶品紅染色法觀察根尖染色體數[5]。

1.3.2 流式細胞術測定染色體倍性

美國貝克曼Quanta.SC流式細胞儀檢測染色體倍性，利用隨機軟件Cell Lab QuantaTM獲取數據和直方圖[8]。

1.4 不同倍性草莓植株葉片結構和細胞厚度測量

參照Solarbio番紅-固綠染色液G1375試劑盒使用說明操作。

染色結果：細胞核和木質化細胞壁呈鮮艷的紅色，細胞質和纖維素的細胞壁呈綠色。

測量與數據統(tǒng)計：番紅-固綠染色片子在200倍或400倍鏡下觀察并拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件分別測量植株葉片上表皮細胞、柵欄組織細胞、海綿組織細胞和下表皮細胞的直徑，結果以均值±方差表示。

1.5 花藥活力測定

采用TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色法測定小蕾期、中蕾期、大蕾期、開花第1～5天的花藥活力，顯微鏡觀察并統(tǒng)計有活力的花粉數目[2]。

1.6 植株性狀觀察與果實品質測定

對2個親本和種間雜交后代進行田間性狀觀察，采集RG、紅玉、RH28健康成熟果實，采用ATAGO便攜式固形物含量測定儀進行可溶性固形物(TSS)含量測定，采用質構儀(CT3，美國Brookfield)進行硬度測定，測定方法參照文獻[2，9]。

2 結果與分析

2.1 去雄結果

田間調查結果表明，去雄套袋的親本RG和紅玉均未得到正常膨大的果實和種子，說明去雄效果較好。

2.2 種間雜交結實與種子出苗情況

RG和紅玉草莓正反種間雜交結實和播種實生苗出苗情況見表1。雜交結實率紅玉×RG為15%，低于RG×紅玉的22%；RG×紅玉平均單果獲種子數為9.8粒，多于紅玉×RG的4.8粒；紅玉×RG的實生苗出苗率為20.83%，大于RG×紅玉的12.04%。由表2倍性檢測結果可知，紅玉×RG種間雜交后代倍性高于RG×紅玉，推測倍性低種子出苗較差。

表1 不同倍性草莓種間雜交結實和種子出苗情況Table 1 Seed setting and emergence of different ploidy strawberry interspecific hybrids

2.3 種間雜交后代染色體倍性檢測

分別對46株RG×紅玉實生苗和15株紅玉×RG實生苗進行流式細胞術染色體倍性檢測，RG為CK1，紅玉為CK2，結果如表2所示。RG×紅玉雜交后代中2x、3x、4x、5x、6x植株占比分別為19.57%、45.65%、19.57%、13.04%、2.17%，4x以下的低倍性實生苗占了84.79%；紅玉×RG雜交后代3x、4x、5x、6x植株占比分別為20.0%、26.67%、26.67%、26.67%，未檢出2x植株，4x以下的低倍性實生苗占比46.67%。

采用根尖染色體數卡寶品紅染色法和流式細胞術檢測細胞核DNA相對含量，對2個親本RG、紅玉，以及種間雜交后代RH28植株分別進行了染色體倍性檢測。結果表明，RG根尖染色體數為14條(2n=2x=14)、細胞核DNA相對含量210.7；紅玉根尖染色體數為56條(2n=8x=56)，細胞核DNA相對含量802.3；RH28根尖染色體數為42條(2n=6x=42)，細胞核DNA相對含量612.3(圖1、表2)。

G0/G1，DNA合成前期；S ohase，DNA合成期；G2，DNA合成后期。G0/G1， DNA synthesis prophase; S ohase， DNA synthesis stage; G2， Last stage of DNA synthesis。圖1 不同倍性草莓植株染色體倍性Fig.1 Chromosome ploidy of different ploidy strawberry plants

表2 種間雜交后代倍性流式細胞檢測結果Table 2 Test results of flow cytometry on ploidy of interspecific hybrid progeny

續(xù)表2 Continued Table 2

2.4 不同倍性草莓植株性狀比較

2.4.1 葉片組織

用番紅-固綠染色法觀察不同倍性(2x RG、8x紅玉和6x RH28)草莓植株葉片結構，測量各細胞厚度。由表3、圖2可見，紅玉葉片上表皮厚度為(33.46±4.58)μm，大于RH28和RG，但差異未達顯著水平(P>0.05)；紅玉葉片柵欄組織厚度最大，為(10.48±2.11)μm，顯著(P<0.05)大于RH28和RG；紅玉葉片海綿組織厚度為(11.85±1.71)μm，顯著大于RG，RH28葉片海綿組織厚度居中，為(11.04±1.01)μm；紅玉和RH28的葉片下表皮厚度分別為(17.53±2.15)μm和(17.36±1.85)μm，均顯著大于RG。試驗結果表明，葉片組織結構厚度與基因倍性成正比。

圖2 不同倍性植株葉片組織電鏡圖Fig.2 Electron micrograph of leaf tissue of different ploidy plants

表3 不同倍性植株葉片細胞厚度比較Table 3 Comparison of cell thickness in leaves of different ploidy plants μm

2.4.2 株型、花粉活力、果實品質

從圖3、表4、表5可見，RG植株矮，分枝極多，匍匐莖抽生困難；開花時花朵小，雄蕊數少，僅在小蕾期有少量具有活力的花藥，花粉活力為(16.74±3.16)%，其余各階段均未檢測到花粉活力；果實軟，硬度為59.8 g·cm-2，果實含水量為83.97%，口感軟綿，種子外凸，TSS含量為11.5%。紅玉植株匍匐莖抽生正常，可通過匍匐莖繁苗保存種源；紅玉花粉活力強且花粉量多，各階段均有一定的花粉活力，在大蕾期和開花第1天達到高峰，花粉活力分別為(49.41±3.91)%和(57.29±2.33)%；果實硬度為366.4 g·cm-2，果實含水量為93.20%，汁水豐富口感好，TSS含量為7.8%。種間雜交后代RH28植株略高于RG，分枝數少于RG，能抽生少量匍匐莖，可通過匍匐莖繁苗保存種源；花朵大小和雄蕊數介于2個親本之間，在花期各階段均能檢測到花粉活力，花粉活力的變化趨勢與紅玉相同，在大蕾期和開花第1天達到高峰，花粉活力分別為(32.13±4.42)%和(35.92±3.61)%，各階段的花粉活力小于紅玉，但大于RG，這利于后續(xù)用栽培種回交提高雜交成活率；果實硬度為184.2 g·cm-2，果實含水量為89.70%，TSS含量為10.4%，種子凸于果面。

表5 不同倍性草莓的果實硬度、含水量、TSS含量比較Table 5 Hardness， water content and TSS content of different ploidy strawberries

3 結論與討論

本研究通過不同倍性草莓的種間雜交獲得了5x、6x等不同倍性草莓材料，并對六倍體種間雜種RH28的植株形態(tài)、品質性狀等進行了鑒定。結果表明，2x RG和8x紅玉的正反交試驗中，RG×紅玉的雜交結實率高于紅玉×RG，這與RG作母本時嚴格控制授粉時間在大蕾期至開花第3天，并授予足夠量的父本花粉有關，而RG作父本時其花藥僅在小蕾期有弱活性，花粉量少且活性弱導致雜交結實率低下，這與王淑珍等[2]的試驗結果一致。但種間雜交的不親和性使二組雜交組合的雜交結實率遠低于常規(guī)栽培品種之間(8x×8x)的雜交結實率(一般均可達90%以上)。RG×紅玉雜交種子出苗率低于紅玉×RG，RG×紅玉雜交后代中4x以下的低倍性占了84.79%，而紅玉×RG雜交后代4x以下的低倍性占比46.67%，表明出苗率與雜交后代低倍性占比高低相關，這2個試驗結果印證了低倍性野生種源與栽培種雜交時易產生雜交不結實、雜交種子成活率低等不親和現(xiàn)象。RG×紅玉雜交后代實生苗中3x植株占比為45.65%，2x、3x合計占比約達80.00%；而紅玉×RG雜交后代中未檢出2x植株，3x、4x、5x、6x植株的占比較接近，這可能與雜交后代性狀遺傳以母本為主導相關，雜交后代染色體倍性與母本存在較大的關聯(lián)性。2組種間雜交組合獲得了2x、3x、4x、5x、6x等多種倍性的種間雜交后代，這應該與草莓中除正常減數配子外還存在未減數配子相關。時翠平等[4，10]研究發(fā)現(xiàn)，在草莓中存在未減數配子；細胞學研究結果表明，草莓2n花粉的形成主要是由于減數分裂過程中，中期2個紡錘體的定向發(fā)生改變所致，由正常的十字形變?yōu)槠叫行魏桶俗中危M而形成了二分體和三分體，每個二分體產生2個2n花粉，每個三分體產生1個2n花粉和2個n花粉，此外還發(fā)現(xiàn)有極少量4n花粉。Bringhurst等[11]利用8x智利草莓和2x森林草莓雜交得到5x、6x、9x后代，認為5x來自雙親正常減數配子，6x來自森林草莓的未減數配子，9x來自智利草莓的未減數配子。此外，草莓屬種間雜交發(fā)現(xiàn)偏母實生苗，研究認為它們來源于假受精的無融合生殖[7]。

種間雜交后代變異大，在創(chuàng)造新種質、新類型、新品種方面具有獨特之處。國內外科學家已通過種間雜交得到了具有優(yōu)良特質的多種倍性材料，加快了野生草莓資源的利用步伐[1，3-7，10-12]。本試驗所獲種間雜交后代RH28在植株葉片細胞組織結構株型、TSS含量等方面介于父母本之間，但RH28已克服了母本RG匍匐莖抽生難這一缺點，可以通過抽生匍匐莖繁殖保存種源；同時RH28改善了母本RG花粉活力低、有活力花粉時期短的缺陷，在各個階段均有一定量的花粉活力，這為后續(xù)繼續(xù)用8x栽培種回交進行漸滲系創(chuàng)制、選育新品種提供了基礎。

試驗中我們關注到在大棚常規(guī)栽培條件下二倍體野生型黃毛草莓、東北草莓只開花，不能正常結果，僅有二倍體森林草莓RG能正常結果，但RG出現(xiàn)了花藥敗育現(xiàn)象，花藥僅在小蕾期有弱活性，這也是紅玉×RG雜交結實率低的主要原因。后續(xù)我們將從形態(tài)學、生理、蛋白質組學等多方面進行研究，探尋RG花藥敗育的機理。種間雜種鑒定方法包括了形態(tài)學觀察、染色體數目檢測、同功酶鑒定、原位雜交、分子生物學技術等。流式細胞術因其快速、簡便、所需樣品量少等優(yōu)點在染色體倍性快速鑒定中得到廣泛應用，但倍性鑒定存在一定誤差?？▽毱芳t染色法染色體倍性鑒定準確度高，但草莓屬植物染色體小，多倍體種染色體數目眾多，染色體觀察難度大、操作技術要求高。本試驗種間雜種鑒定方法采用形態(tài)學和染色體數目檢測，根據流式細胞術快速鑒定結果，結合田間觀察挑選部分種間雜交后代進行卡寶品紅染色法倍性鑒定驗證。后續(xù)我們將利用多種方法對種間雜種進行鑒定，以期挖掘更多有價值的種間雜交后代。