郭凱紅，趙衛(wèi)國，王曉東，李殿榮，田建華，李保軍，陳文杰，尚麗平，張立堅，羅 斌，王 灝，栗茂騰

(1.陜西省雜交油菜研究中心，陜西 楊凌 712100；2.江蘇農(nóng)業(yè)科學院 經(jīng)作所，江蘇 南京 210014；3.華中科技大學 生命科學與技術(shù)學院，湖北 武漢 430074)

油菜是我國的第一大油料作物，種植面積常年維持在666.7萬hm2左右，年產(chǎn)量超過1 400萬t[1, 2]，菜籽油產(chǎn)量占國產(chǎn)油料作物產(chǎn)油量的55%以上[3]。然而，我國食用油對外依存度依然很高，2017年的進口比例已達69.2%，進口油菜占國內(nèi)市場的份額不斷增加[4]，因此，在現(xiàn)有種植面積上，提高油菜籽含油量，選育高含油量品種應是緩解我國菜籽油供需矛盾的有效途徑。 近年來，通過常規(guī)育種結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)等培育的油菜種質(zhì)資源含油量不斷提升，如華中農(nóng)業(yè)大學傅廷棟[5]、江蘇農(nóng)科院傅壽仲[6]、中國農(nóng)科院王漢中[7]等先后選育出了一批含油量超過50%的新品系。本研究團隊長期致力于高油種質(zhì)創(chuàng)新和育種研究應用，通過對國內(nèi)外不同遺傳背景的油菜品系進行小孢子培養(yǎng)、基因聚合和生態(tài)穿梭獲得了一大批含油量50%以上、部分達到60%以上的高油種質(zhì)資源，并育成了含油量超過50%的我國第一個雜交油菜品種“秦雜油4號”[5]。我國有著豐富的高含油種質(zhì)資源，但對高油種質(zhì)資源之間的遺傳多樣性卻鮮有研究，品種間的親緣關系也不明確，優(yōu)良的高油親本不能被有效充分利用。因此研究高油種質(zhì)資源間的遺傳多樣性，拓寬高油品種的遺傳基礎，對高油育種親本的選擇和雜交組合選配具有重要的指導意義。

SRAP分子標記分布均勻、重復性好、簡單易操作、花費少，已被廣泛應用于油菜等作物的遺傳育種研究[8]。文雁成、王漢中等[9]用 SRAP 標記分析中國甘藍型油菜品種的遺傳多樣性和遺傳基礎進行分析，發(fā)現(xiàn)我國近60%的甘藍型油菜品種遺傳多樣性較匱乏。張羽等[10]用SRAP 標記結(jié)合 SSR 標記對陜南地區(qū)油菜主要育種材料的遺傳多樣性進行分析，結(jié)果顯示56 份該地區(qū)甘藍型油菜自交系中多數(shù)材料親緣關系較近，在育種中需要創(chuàng)新種質(zhì)資源。陳玉峰等[11]用SRAP標記對甘藍型油菜品種進行含油量的遺傳多樣性進行研究，表明高含油量供試品種間存在著較大的遺傳差異。王燕惠等用[12]SRAP分子標記對國內(nèi)外43份甘藍型油菜材料進行遺傳多樣性分析，也發(fā)現(xiàn)參試材料差異較大，彼此之間存在不同程度的親緣關系。對甘藍型油菜育種材料遺傳多樣性的研究較多，但目前還未見對甘藍型油菜高油種質(zhì)(含油量高于50%)群體間的遺傳多樣性進行詳細地分析報道。

筆者研究以不同來源的54份高油油菜品系為材料，利用 SRAP 分子標記技術(shù)對其遺傳關系進行分析，以期理清高含油量油菜種質(zhì)資源間的分子遺傳關系，為后續(xù)親本選配和雜種優(yōu)勢預測提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料由陜西省雜交油菜研究中心提供，共54份，來源于國內(nèi)外不同地區(qū)，通過聚合雜交、小孢子培養(yǎng)、生態(tài)、黃籽、高油雜交優(yōu)勢等育種技術(shù)多年創(chuàng)制而成。

1.2 品質(zhì)檢測

供試材料的含油量用德國BRUKER公司的PC-120核磁共振儀(NMR)進行測定，其測定方法參照王竹云等[13]。油菜籽粒的芥酸、硫甙含量用近紅外反射光譜儀(NIRS)測定，由陜西省雜交油菜研究中心品質(zhì)分析檢測室檢測，具體方法參照陳文杰等[14]。

1.3 SRAP標記檢測

1.3.1 DNA的提取 油菜總DNA的提取采用王灝等優(yōu)化后的SDS法[15]。提取好的DNA，溶解在 TE 溶液中，用核酸分析儀測定其濃度，保存在-80℃ 備用。

1.3.2 SRAP引物組合選擇及PCR擴增 SRAP引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，通過引物組合篩選比較，從中選取多態(tài)性豐富的SRAP引物組合8對。

PCR擴增反應 反應體系：2 μl 10×Buffer(含 20 mmol·L-1Mg2+)、0.5 μl 10 mmol·L-1dNTPs、上/下游引物(20 μmol·L-1)各1μL、2 μL DNA 模板(約 30 ng)、0.4 U Taq DNA 聚合酶，加ddH2O 至20 ul。反應程序為94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 1 min，35 ℃復性 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 5 個循環(huán)；94 ℃變性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 30 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對54份高油材料進行SRAP擴增，將電泳圖譜上清晰的條帶記為“1”，無條帶的記為“0”，構(gòu)建 0/1 矩陣圖。利用POPGENE 32 軟件對SRAP 分子標記的結(jié)果進行包括引物擴增總條帶數(shù)(TNB)、多態(tài)性條帶數(shù)(NPB)、多態(tài)性條帶百分比(PPB)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)和多態(tài)性信息含量(PIC)等遺傳多樣性參數(shù)分析。用 NTSYS-pc2.10軟件中的中 DICE 法計算遺傳相似系數(shù)，用非加權(quán)平均法(UPMGA)進行聚類構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 高含油量油菜品系相關性狀分析

54份高含油量油菜品系材料背景來源、含油量、芥酸、硫苷、種皮色澤等相關性狀見表1。從表1可以看出，高油品系來自加拿大、韓國、英國和我國陜西、湖北、貴州、青海、西藏等不同地域背景材料。通過對不同背景來源的高油品系進行分析，含油量49.98%～58.05%，其中55%以下材料38份，大于55%的材料16份。

芥酸是油分構(gòu)成中的一種脂肪酸，是重要的品質(zhì)性狀，筆者研究的高油品系中高芥酸材料22份，低芥酸材料32份(占59.62%)。在不同高油構(gòu)成中，含油量55%以下的低芥品系占52.63%，55%以上品系中低芥酸占到75%，表明經(jīng)過高油和低芥酸目標改良選擇，在低芥酸的背景下同樣可以獲得高油，芥酸和含油量的相關性可通過遺傳改良打破。低芥酸的高油種質(zhì)成為高油種質(zhì)創(chuàng)新的必要要求。硫苷是油菜又一重要的品質(zhì)性狀指標，其主要存在于籽粕中。筆者研究的高油品系中低硫苷品系有43份，占到79.63%，不同程度高油中，55%以下30份，55%以上13份，分別占比78.95%和81.25%。該數(shù)據(jù)表明低硫苷改良和高油沒有相關性，是不同的遺傳性狀方向。對照雙低目標，其品系雙低率為51.85%。

粒色深淺影響種皮厚度和種皮在種子中的占比，進而影響含油量。筆者研究的高油品系中，黑粒、五花中間色和黃粒的材料份數(shù)分別為13、13和28，各占比例為24.07%、24.07%和51.85%，黃籽材料數(shù)量居多。而含油量在55%以下的占比為黑、中、黃分別為28.95%、23.68%和47.37%；55%以上的對應比例則為12.5%、25%和62.5%，表明隨著含油量的提升，黑籽深色種質(zhì)數(shù)量在減少，五花、黃色淺色種皮種質(zhì)數(shù)量在增多。按黑粒、五花、黃粒色統(tǒng)計平均含油量是52.75%、53.27%、53.58%，黃粒相對較高[5]，體現(xiàn)了高油和粒色具有顯著的相關性。同時，在不同粒色中皆有較高含油量的種質(zhì)，表明除粒色外，其種仁的含油量起到了更重要的貢獻作用，高油的形成是油分貢獻基因協(xié)作共同遺傳表達的結(jié)果。

表1 高含油材料品質(zhì)分析結(jié)果

續(xù)表1 高含油材料品質(zhì)分析結(jié)果

2.2 高油油菜品系的SRAP結(jié)果分析

研究從100多對SRAP引物組合中篩選出具有條帶清晰、穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富的引物組合8對。通過8對引物組合對54個材料的SRAP分析，共獲得電泳條帶113個，各引物擴增條帶數(shù)目分別在 8～26 之間，平均14.13個。其中多態(tài)性條帶83個，Rem12/Fme3組合擴增的多態(tài)性位點最多，達到17個，Rem14/Fme8組合擴增多態(tài)性位點最少，僅為5個，平均多態(tài)條帶10.38個，多態(tài)率為73.45%。 這表明SRAP 標記對油菜種質(zhì)資源遺傳背景具有較強的鑒別能力，適合用于遺傳分析的研究。

利用POPGENE 32 軟件對SRAP 分子標記的結(jié)果進行處理，發(fā)現(xiàn)有效等位基因數(shù)(Effective number ofalleles，Ne)的變異范圍為 1.45～2.0，平均為 1.74；Nei’s基因多樣性指數(shù)(Neil’s sgenediversity，H)分布在1.28～1.69，均值為1.46；Shannon’s 信息指數(shù)(Shannon’s information index，I)介于 0.17～0.4，平均值為0.27。當多態(tài)性信息含量PIC(Polymorphism information content)>0.5時，該基因座為高度多態(tài)基因座；0.25

表2 高含油材料 SRAP 標記遺傳多樣性參數(shù)

2.3 高含油量油菜品系的聚類分析

根據(jù)上述SRAP分析結(jié)果，計算54份高含油量油菜品系之間的遺傳相似系數(shù)，利用UPGMA法進行聚類分析，構(gòu)建樹狀聚類圖(圖1)。聚類圖中的油菜品系編號與表1的油菜品系編號一致。聚類結(jié)果顯示：54份材料的遺傳相似系數(shù)在0.71～0.98之間，在相似性系數(shù)為0.73時，可將供試品系分為三大類，第一類為油研9號和23569兩份材料構(gòu)成，第二類是中油雜2號一個品系，剩余51份材料構(gòu)成最大的第三類群，占比94.44%，表明第一類和第二類的3份材料與其他資源遺傳關系相對較遠。在相似性系數(shù)0.78處，可將供試材料分為6個類群，其中I、II類和上面一致，第三類再被分成III、IV、 V、VI四類，該分類更能詳細地對所選資源進行分析、充分說明問題。

依照相似性系數(shù)0.78處的分類，I類有23569和油研9號兩份材料，II類有中油雜2號1份材料、III類西藏35單個材料、IV類由大白菜DW08和L45兩材料構(gòu)成，四大類共有6份材料，占總材料數(shù)的11.11%，分別由加拿大、我國的貴州、湖北、西藏和陜西的甘藍型油菜資源背景以及白菜型油菜源選育而來，體現(xiàn)了地域和亞種間資源背景的特異性，其遺傳距離相對較遠。第V類有38份材料，是最大的類群，可分成A、B、C、D 4個亞類，加拿大的23560單獨在A亞類；春陜2B、440-1-87和9801三材料在B亞類；平陸芥菜/A74、Altex/864B、加曼42等18份聚在C亞類，其中黃粒14份，雙低品質(zhì)11份，含油量較高；L03-29、西藏69、青9917等16份材料被聚在D亞類，不同種皮色的材料數(shù)接近(黑∶中∶黃=5∶6∶5)，含油量低于55%的材料居多，有13份。第VI類有10份材料，包括中油821選、7794-54(無花瓣)、Slovx、韓2、陜3B等，黑色種皮材料5份，黃色材料4份，中間色材料1份，絕大多數(shù)材料油低于55%。該類可分成兩個亞類，21H混-5、start/1666B-1和加0023622三個雙低材料為一亞類，其他7份為另一亞類。

3 討論

含油量是油料作物-油菜最重要的性狀之一，提高含油量始終是油菜品種選育的重點目標，其中的關鍵無疑是高油種質(zhì)創(chuàng)新。近年來，通過各種常規(guī)和現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合，外加核磁共振儀、近紅外儀等無損傷快速品質(zhì)測定技術(shù)的應用，使大量高油種質(zhì)創(chuàng)新及篩選成為可能，有力地促進了高油種質(zhì)創(chuàng)新效率。筆者研究所選高油材料的含油量多年表現(xiàn)穩(wěn)定且最高接近60%的材料，材料來自不同國別和我國主要油菜主產(chǎn)區(qū)的不同品種(系)，有自然演化的品種(系)，有人工合成和亞基因組間雜交的品種(系)，生態(tài)類型有春性、冬性和半冬性，品質(zhì)性狀有雙低、單低和雙高的，育性背景有與GMS、CMS雜優(yōu)利用緊密相關的對應保持系、恢復系種質(zhì)，也有育種目標特殊性狀的資源，如緊湊株型、大粒、角果上挺、黃籽等，其中很多資源是我國的重要推廣品種或重要品種的親本以及國際上的一些重要資源，性狀表現(xiàn)具有較突出的特異性、穩(wěn)定性和一致性，材料選擇具有典型性和代表性。

種質(zhì)資源的豐富度、親本組合遺傳關系的遠近以及親緣系數(shù)的大小等遺傳背景是改善作物性狀最重要的因素，因此了解種質(zhì)資源的遺傳多樣性十分有必要。前人已經(jīng)利用SRAP分子標記技術(shù)對國內(nèi)甘藍型油菜種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性研究。臧珊等[16]在研究甘藍型油菜骨干親本的遺傳多樣性時，也發(fā)現(xiàn)SRAP標記較少SSR更有優(yōu)勢，擴增出的多態(tài)性條帶更多，多態(tài)率更高。王燕惠等[12]通過對國內(nèi)外43份甘藍型油菜材料進行遺傳多樣性分析，多態(tài)性比率為52.5%，平均每對引物為3.8個多態(tài)性位點。張書芬等[17]采用SRAP標記對甘藍型油菜品種的多態(tài)性進行分析，平均多態(tài)性條帶5.8條，每對引物組合產(chǎn)生的多態(tài)性帶的比例為18.75%～38.89%，平均為28.23%。筆者研究也使用該方法對高油種質(zhì)間的遺傳多樣性進行了分析，SRAP結(jié)果顯示平均多態(tài)性條帶10.38，平均多態(tài)率為73.46%，平均每對引物的多態(tài)性位點為14.13個，平均多態(tài)率和多態(tài)位點遠高于張書芬[17]、王燕惠[12]等，說明供試材料多態(tài)性較為豐富。

基于SPAP的聚類分析將54份材料分為6大類群，各類群材料沒有與地域來源、含油量、粒色、品質(zhì)等性狀呈現(xiàn)出單一的指向性關系，但仍有較為明顯的特征和趨勢性規(guī)律，如當遺傳系數(shù)為0.78時，75%的黃籽材料都被聚類到第Ⅴ類群，說明黃籽材料背景具有較近的遺傳關系，這與薛漢軍[18]等研究結(jié)果一致。筆者研究中，黃籽極高油(55%以上)、黃籽普通高油(50%～55%)、黑籽極高油、黑籽普通高油也分別分布在對應亞群中，尤其黃粒極高油除start/1666B-1外均分在Ⅴ類群中。眾多研究表明，種質(zhì)資源聚類與地理來源密切相關[19]，但筆者研究通過對聚類分布的地域因子進行分析，發(fā)現(xiàn)該因素對類群分布的貢獻率較小，具體表現(xiàn)為同一地域來源的材料有的聚為一類，有的分屬不同的大類或亞類，而部分不同地域的材料卻被分在一起，與葉威等[20]等研究結(jié)果有差異，這是因為育種材料或品種本身就是一個各種優(yōu)良性狀的復雜聚合，同一地域來源的材料，其遺傳背景并不一定簡單一致。此外，遠源背景種質(zhì)表現(xiàn)也各有不同，白菜源的大白菜DW08/K407和大多數(shù)材料距離較遠，而芥菜源的平陸芥菜/A74和亞基因組置換材料孟晚C-64并沒有表現(xiàn)出與其他高油材料較遠的遺傳關系，這可能與后續(xù)改良過程中選擇的傾向性有關，本實驗中所選的高油材料品質(zhì)性狀有雙高低、單低和雙高，類群劃分與芥酸、硫苷含量的高低無明顯規(guī)律，因而高油和芥酸、硫苷的關聯(lián)性相對較低，可能主要受育種選育目標影響。最終聚類結(jié)果是DNA水平的差異表現(xiàn)，是各種性狀基因背景的綜合反映，對應在類群與性狀的關系上是一種多性狀交互關聯(lián)在一起形成的復雜綜合體現(xiàn)。因此，高油育種應挖掘和利用遺傳關系較遠的、多樣性較高的優(yōu)良品系，拓寬遺傳基礎，為油菜高油品種的選育提供指導方向。