姚 丹,牛舒琪,趙 祺,曹 靖,韓慶慶,李慧萍,緱晶毅,張金林,*

1 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室草地微生物研究中心, 蘭州 730020 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心,蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 蘭州 730020

土壤鹽漬化是降低植物生產(chǎn)力、制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要非生物脅迫因素之一[1]。全球大約10億hm2的土壤受到鹽漬化的威脅,中國(guó)鹽漬化土地約占全球鹽漬土面積的1/10[2]。鹽脅迫對(duì)植物的影響主要有：鹽離子毒害、減弱植物吸水能力、產(chǎn)生氧化脅迫、使葉片膨脹受損并誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉和降低光合能力等,從而降低其生物量和繁殖成功率,阻礙農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展[2- 5]。土壤鹽漬化導(dǎo)致可用土地面積大量減少,土地可利用率降低,生產(chǎn)成本增加,成為可持續(xù)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)發(fā)展的一個(gè)重大問題。

由于土壤鹽漬化進(jìn)程的加快和草地灌溉中污水使用量的增加,在許多地區(qū)草坪草受到土壤鹽堿化影響的程度日益加深[6]。多年生黑麥草(Loliumperenne)是我國(guó)廣為應(yīng)用的一種冷季型草坪草,分蘗能力強(qiáng),生長(zhǎng)迅速,覆蓋力強(qiáng),品質(zhì)優(yōu)良,適應(yīng)范圍廣,因此常作為建植草坪草地的先鋒草種[7- 8]。同時(shí),多年生黑麥草也是一種品質(zhì)優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)牧草,莖葉繁茂,幼嫩多汁,產(chǎn)草量高,再生性強(qiáng),為各種家畜所喜食,在我國(guó)南方地區(qū)廣為栽培[9- 10]。多年生黑麥草對(duì)高溫、寒冷和干旱環(huán)境都有一定的適應(yīng)性,但當(dāng)其生長(zhǎng)環(huán)境鹽分過高時(shí),生長(zhǎng)明顯受到抑制,在商業(yè)栽培品種中其耐鹽性僅為中等水平[11- 12]。因此,研究如何提高多年生黑麥草的耐鹽性,對(duì)草坪建植和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn),一些定殖于植物根際的土壤細(xì)菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、減少植物病害發(fā)生率以及提高植物抗脅迫能力的特點(diǎn),Kloepper和Schroth 于1978年將此類細(xì)菌命名為根際細(xì)菌,1981年又將這類具有促生作用的根際細(xì)菌正式命名為根際促生細(xì)菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR)[13-15]。研究表明,PGPR可以通過直接作用和間接作用兩大機(jī)制提高植物生產(chǎn)力,直接作用包括提高植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的生物可得性和影響植物激素的濃度,如溶磷,生物固氮,產(chǎn)生吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素和乙烯等小分子,生成鐵載體和1-氨基環(huán)丙烷- 1-羧酸(ACC)脫氨酶等;間接作用包括干擾群體感應(yīng)信號(hào)和抑制生物膜的形成,發(fā)揮抗真菌活性,誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性,促進(jìn)微生物和植物共生,產(chǎn)生干擾病原體毒素的等,從而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[16- 18]。

分布于我國(guó)新疆、甘肅西部、寧夏西北部、青海北部、內(nèi)蒙古的梭梭(Haloxylonammodendron),是藜科(Chenopodiaceae)梭梭屬多年生灌木或小喬木,由于其具有較強(qiáng)的抗旱耐鹽性,已成為我國(guó)多個(gè)沙漠地區(qū)植被恢復(fù)的重要樹種。梭梭具有強(qiáng)大的根系,垂直根系一般深為5 m,水平根系伸展可達(dá)10 m,且其具有較強(qiáng)的根際正效應(yīng),據(jù)此推測(cè)其根系可以為PGPR提供一個(gè)獨(dú)特的棲息地,從而幫助其適應(yīng)極端環(huán)境[19- 21]。因此,把目光聚焦在梭梭根際促生細(xì)菌上,研究其對(duì)多年生黑麥草的接種效應(yīng),以期為新型草坪草微生物菌肥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

課題組前期分別從內(nèi)蒙古阿拉善右旗(巴丹吉林沙漠)和甘肅民勤(騰格里沙漠)不同生長(zhǎng)時(shí)期的梭梭根際土壤中分離純化獲得293株細(xì)菌,發(fā)現(xiàn)多株具有PGPR特性。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株WM13- 24對(duì)模式植物擬南芥具有明顯的促生作用,本研究將菌株WM13- 24接種于多年生黑麥草,研究其對(duì)黑麥草幼苗生長(zhǎng)及耐鹽性調(diào)控的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌菌株WM13- 24 (16S rRNA基因序列在GenBank的注冊(cè)號(hào)為MN582985)分離于冬季甘肅民勤騰格里沙漠的13年樹齡梭梭根際土壤,陽性參考菌株枯草芽孢桿菌GB03由美國(guó)德州理工大學(xué)Paul W. Paré 教授提供,陰性對(duì)照大腸桿菌菌株(Escherichiacoli) DH5ɑ購(gòu)自中國(guó)大連Takara生物技術(shù)有限公司,多年生黑麥草種子“紳士”(Loliumperenne‘Esquire’)由北京綠冠種業(yè)發(fā)展有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌液的制備及處理

LB液體培養(yǎng)基以10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨和5 g/L酵母粉的比例配制,使用標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)(PB- 10,北京賽多利斯)調(diào)節(jié)pH至7.2;將立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX- 50KBS,上海申安)溫度調(diào)至121℃對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌20 min;待其冷卻后,在超凈工作臺(tái)上加入菌液,每100 mL的LB液體培養(yǎng)基分別添加100 μL的WM13- 24、GB03和DH5ɑ菌液;接著在28℃、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下的恒溫培養(yǎng)搖床(THZ- 300,上海一恒科技)中培養(yǎng)過夜;使用紫外可見分光光度計(jì)(V- 5800型)測(cè)定菌液濃度,調(diào)節(jié)濃度至OD600=0.90時(shí)取出備用。

1.2.2幼苗培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)采用盆栽,每盆裝有高溫滅菌(烘箱80℃滅菌8 h)的細(xì)沙和蛭石(體積比1∶1)共1500 g。每盆混合土中加入上述濃度調(diào)節(jié)至OD600=0.90的菌液10 mL,空白對(duì)照加入LB液體培養(yǎng)基10 mL,攪拌混勻后每盆均勻播種1.5 g黑麥草種子。待幼苗生長(zhǎng)7 d后,對(duì)其進(jìn)行間苗處理,每盆保留10株生長(zhǎng)一致的幼苗。幼苗繼續(xù)生長(zhǎng)20 d后,往各對(duì)照組和處理組每株幼苗補(bǔ)接種上述菌液1 mL,并添加不同鹽濃度(0, 150, 300 mmol/L NaCl)的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液,在鹽處理2周后測(cè)定相關(guān)生理數(shù)據(jù)。

1.3 生長(zhǎng)生理指標(biāo)測(cè)定

分別取各處理的幼苗,沖洗干凈植物表面的灰塵,使用稱重法稱取地上部鮮重,用直尺直接測(cè)量根長(zhǎng),再將稱過重量的樣品烘至恒重后稱取干重。用乙醇丙酮混合液浸提法測(cè)定葉綠素含量;用TTC(氯化三苯基四氮唑)法測(cè)定幼苗根系活力;用DDS- 11C型電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率,以相對(duì)電導(dǎo)率表示細(xì)胞膜相對(duì)透性;使用冰點(diǎn)滲透儀(OSMOMAT- 030, Germany)測(cè)定滲透勢(shì);采用蒽酮比色法對(duì)可溶性糖含量進(jìn)行測(cè)定;使用脯氨酸(Pro)含量測(cè)定試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測(cè)定脯氨酸含量;使用過氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測(cè)定過氧化氫酶(CAT)活性;采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)的含量(表1)。

將待測(cè)幼苗地上部烘干搗碎后放入試管,添加100 mmol/L濃度的冰乙酸10 mL,密封置于90℃水浴鍋中反應(yīng)2 h,待其冷卻至室溫,然后過濾,用火焰分光光度計(jì)(Sher wood 410)測(cè)定吸光值,最后結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算Na+、K+離子含量 (mmol/gDW) (表1)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理設(shè)置12個(gè)重復(fù),所有圖中的數(shù)值為平均值± SE;數(shù)據(jù)使用Excel 2010作圖,中文版SPSS 17.0 (美國(guó)伊利諾斯州芝加哥SPSS公司)進(jìn)行差異顯著性分析(P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下WM13- 24對(duì)黑麥草生長(zhǎng)的影響

圖1 鹽脅迫下根際促生細(xì)菌對(duì)多年生黑麥草幼苗生長(zhǎng)和地上部生物量的影響Fig.1 Effects of the PGPR strains on growth and shoot biomass of perennial ryegrass under salt treatmentsFW：鮮重,Fresh weight;DW：干重,Dry weight

正常條件下,接種根際促生細(xì)菌的黑麥草幼苗根系長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于LB空白對(duì)照和DH5α陰性對(duì)照,尤其是菌株WM13- 24處理的幼苗側(cè)根發(fā)育顯著優(yōu)于其他處理;150 mmol/L NaCl處理2周時(shí),接種根際促生細(xì)菌的幼苗地上部和根系生長(zhǎng)均顯著優(yōu)于空白與陰性對(duì)照;300 mmol/L NaCl處理2周時(shí),根際促生細(xì)菌處理的幼苗與空白和陰性對(duì)照比較,根系更為發(fā)達(dá),分蘗數(shù)更多(圖1)。150 mmol/L NaCl處理2周時(shí),菌株GB03和WM13- 24處理的幼苗地上部鮮重與空白對(duì)照相比提高了19.79%和24.09%,干重分別增加了24.18%和顯著提高了36.11% (P< 0.05);300 mmol/L NaCl處理2周時(shí),鮮重分別顯著提高33.42%和45.05% (P<0.05),干重提高11.17%和14.85% (圖1)。

150 mmol/L NaCl處理2周時(shí),接種根際促生細(xì)菌提高了幼苗的葉綠素含量,尤其是WM13- 24處理的幼苗,與空白對(duì)照相比,其葉綠素a和葉綠素b分別顯著增加了44.05%和53.79% (P<0.05),GB03處理的幼苗分別增加了18.56%和16.71%;300 mmol/L NaCl處理下,GB03和WM13- 24處理的幼苗,其葉綠素a含量分別提高17.81%和17.46%,葉綠素b含量分別提高了33.92%和27.72% (圖2)。

圖2 鹽脅迫下根際促生細(xì)菌對(duì)多年生黑麥草幼苗葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of the PGPR strains on chlorophyll content of perennial ryegrass under salt treatment

150 mmol/L NaCl處理2周時(shí), 與空白對(duì)照相比,GB03和WM13- 24處理的幼苗根長(zhǎng)分別顯著提高了48.50%和69.21% (P<0.05);300 mmol/L NaCl處理2周時(shí),與空白對(duì)照相比,GB03處理的幼苗根長(zhǎng)提高了9.58%,WM13- 24處理組顯著提高了24.07% (P<0.05)。其中WM13- 24處理對(duì)根長(zhǎng)的促進(jìn)效果更佳,150和300 mmol/L NaCl處理下,WM13- 24處理下幼苗根長(zhǎng)與GB03處理相比分別顯著提高了13.94%和13.22% (P<0.05) (圖3)。

圖3 鹽脅迫下根際促生細(xì)菌對(duì)多年生黑麥草幼苗根長(zhǎng)和根系活力的影響Fig.3 Effects of the PGPR strains on root length and root vigour of perennial ryegrass under salt treatments

鹽處理2周時(shí),正常生長(zhǎng)條件下,GB03和WM13- 24處理的黑麥草幼苗的根系活力與空白對(duì)照相比提高了19.99%和16.16%。150 mmol/L NaCl處理2周時(shí),GB03和WM13- 24處理的幼苗根系活力與空白對(duì)照相比分別顯著提高了48.28%和49.47% (P<0.05);300 mmol/L NaCl處理2周時(shí),分別顯著提高了47.92%和58.48% (P<0.05) (圖3)。

圖4 鹽脅迫下根際促生細(xì)菌對(duì)多年生黑麥草幼苗過氧化氫酶活性的影響Fig.4 Effects of the PGPR strains on CAT activity of perennial ryegrass under salt treatments CAT：過氧化氫酶,Catalase

2.2 鹽脅迫下WM13- 24對(duì)黑麥草質(zhì)膜完整性的影響

150 mmol/L NaCl處理黑麥草幼苗2周時(shí),與空白對(duì)照組相比,菌株GB03處理的幼苗過氧化氫酶活性提高了45.71%,WM13- 24處理的顯著提高了87.90% (P<0.05);300 mmol/L NaCl處理幼苗2周時(shí),與空白對(duì)照相比,GB03 和WM13- 24處理組分別顯著提高氧化氫酶活性47.51%和64.21% (P<0.05) (圖4)。

150 mmol/L NaCl處理黑麥草幼苗2周時(shí),GB03處理的幼苗相對(duì)質(zhì)膜透性與空白對(duì)照組相比降低了31.65%,WM13- 24顯著降低了43.54% (P<0.05);300 mmol/L NaCl處理2周時(shí),GB03和WM13- 24處理與空白對(duì)照相比分別顯著降低了23.01%和24.56% (P<0.05) (圖5)。300 mmol/L NaCl處理2周時(shí),GB03和WM13- 24處理的幼苗丙二醛含量與空白對(duì)照相比顯著降低了1.22倍和54.24% (P<0.05) (圖5)。

圖5 鹽脅迫下梭梭根際促生細(xì)菌對(duì)多年生黑麥草幼苗丙二醛含量和相對(duì)質(zhì)膜透性的影響 Fig.5 Effects of the PGPR strains on MDA content and relative plasma permeability of perennial ryegrass under salt treatmentsRMP：相對(duì)質(zhì)膜透性透性,Relative membrane permeability;MDA：丙二醛,Malondialdehyde

2.3 鹽脅迫下WM13- 24對(duì)黑麥草滲透調(diào)節(jié)能力的影響

150 mmol/L NaCl處理黑麥草幼苗2周時(shí),菌株GB03和WM13- 24處理的幼苗可溶性糖含量與空白對(duì)照組相比分別提高了42.68%和47.88%;300 mmol/L NaCl處理幼苗2周時(shí),分別顯著提高了1.04倍和84.41% (P<0.05) (圖6)。

圖6 鹽脅迫下梭梭根際促生細(xì)菌對(duì)多年生黑麥草可溶性糖含量,脯氨酸含量和滲透勢(shì)的影響Fig.6 Effects of the PGPR strains on soluble sugar and proline contents and osmotic potential of perennial ryegrass under salt treatments

正常條件下,GB03和WM13- 24處理的幼苗脯氨酸含量較空白對(duì)照組分別顯著提高了58.52%和80.25% (P< 0.05);150 mmol/L NaCl處理2周時(shí),GB03和WM13- 24處理的幼苗脯氨酸含量較空白對(duì)照分別顯著提高了68.81%和1.08倍(P< 0.05);300 mmol/L NaCl處理幼苗2周時(shí),GB03和WM13- 24處理的幼苗脯氨酸含量較空白對(duì)照分別顯著提高了48.68%和82.71% (P< 0.05),WM13- 24與GB03處理的幼苗相比,脯氨酸含量顯著提高了22.88% (P< 0.05) (圖6)。

150 mmol/L NaCl處理幼苗2周時(shí),根際促生細(xì)菌處理的幼苗滲透勢(shì)均低于空白對(duì)照和陰性對(duì)照,GB03和WM13- 24處理的幼苗滲透勢(shì)與空白對(duì)照相比分別降低了26.13%和23.96%;300 mmol/L NaCl處理2周時(shí),分別降低了14.73%和29.08% (圖6)。

2.4 鹽脅迫下WM13- 24對(duì)黑麥草Na+和K+含量的影響

150 mmol/L NaCl處理黑麥草幼苗2周時(shí),用菌株GB03和WM13- 24處理的幼苗,其地上部的K+含量與空白對(duì)照組相比分別提高了13.61%和14.58%,Na+含量降低了34.65%和22.52%,K+/Na+分別提高了52.97%和40.38%;300 mmol/L NaCl處理幼苗2周時(shí),地上部的K+含量分別提高了21.08%和10.80%,Na+含量顯著降低了26.22%和20.17% (P< 0.05),K+/Na+分別提高了59.08%和38.59% (圖7)。

圖7 鹽脅迫下梭梭根際促生細(xì)菌對(duì)多年生黑麥草幼苗Na+和K+含量的影響 Fig.7 Effects of the PGPR strains on Na+ and K+ content of perennial ryegrass under various salt treatments

150 mmol/L NaCl處理黑麥草幼苗2周時(shí),菌株GB03和WM13- 24處理的幼苗根中的K+含量與空白對(duì)照組相比分別提高了15.62%和23.18%,Na+含量降低了36.08%和36.67%,K+/Na+分別顯著提高了57.34%和68.35% (P< 0.05);300 mmol/L NaCl處理2周時(shí),與空白對(duì)照相比根中的K+含量分別提高了25.67%和30.53%,Na+含量顯著降低了27.84%和43.97%,K+/Na+分別顯著提高了65.25%和87.93% (P< 0.05) (圖7)。

3 討論與結(jié)論

鹽脅迫下植物生長(zhǎng)速率變慢,根、莖和葉片生物量顯著下降,生物量一定程度上可反應(yīng)植株的生長(zhǎng)狀況和抵御鹽脅迫的能力[22]。已有的研究表明,接種根際促生菌可促進(jìn)植物在鹽脅迫下的生長(zhǎng)。Chen等[23]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌菌株(Bacillusamyloliquefaciens)SQR9可通過分泌生長(zhǎng)素和赤霉素,促進(jìn)玉米在鹽脅迫下的生長(zhǎng),也可通過上調(diào)參與植物光合作用關(guān)鍵基因RBCS和RBCL,維持玉米在鹽脅迫下的光合速率,顯著提高了玉米在鹽脅迫下的生物量。Siddikee等[24- 25]還發(fā)現(xiàn)接種根際促生細(xì)菌可通過減少鹽脅迫誘導(dǎo)的乙烯從而緩解鹽脅迫對(duì)紅辣椒植株生長(zhǎng)的抑制作用,鹽脅迫下紅辣椒幼苗的生物量與正常條件下持平。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在150和300 mmol/L NaCl脅迫條件下,接種根際促生細(xì)菌均能提高鹽脅迫下黑麥草幼苗地上部生物量,尤其是梭梭根際促生細(xì)菌WM13- 24。另外,在150和300 mmol/L NaCl條件下,接種根際促生細(xì)菌的幼苗葉綠素a及葉綠素b含量均高于空白對(duì)照和陰性對(duì)照,并且在150 mmol/L NaCl處理時(shí),與已商業(yè)化生產(chǎn)的陽性對(duì)照菌株GB03相比,接種WM13- 24能夠更有效的維持黑麥草幼苗葉綠素含量,而葉綠素作為光合作用中的重要參與者,是表征光合利用率最重要的指標(biāo)之一,葉綠素含量的高低直接影響植物的光合能力[2]。植物葉片作為光合作用的重要部位,在植物生長(zhǎng)和抵抗外界脅迫方面起著至關(guān)重要的作用,除此之外,根系作為植物吸收水分和營(yíng)養(yǎng)元素的重要器官,也是反映植物生長(zhǎng)和抗逆能力的關(guān)鍵器官,白玉娥等[26]提出強(qiáng)壯植物根系是提高植物抗性的一種有效途徑,有研究發(fā)現(xiàn)根際促生細(xì)菌能夠促進(jìn)植株根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng),提高根系活力,從而增強(qiáng)植株攝取營(yíng)養(yǎng)的能力,最終改善植物在脅迫條件下的生長(zhǎng)發(fā)育[27]。類似的結(jié)果也在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫下,WM13- 24促進(jìn)了黑麥草根的生長(zhǎng),顯著提高了幼苗的根系活力。因此,WM13- 24可能通過提高鹽脅迫下葉綠素含量以維持鹽脅迫下植物的光合作用,也可能通過促進(jìn)根系的生長(zhǎng),增強(qiáng)植株在脅迫條件下吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力,從而維持幼苗在鹽脅迫條件下的生長(zhǎng),幫助其更好的適應(yīng)鹽逆境。

當(dāng)植物遭受環(huán)境脅迫時(shí),膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,膜滲透性增加,細(xì)胞內(nèi)含物外泄,這種膜變化構(gòu)成了植物細(xì)胞在環(huán)境脅迫下的初始響應(yīng),所以細(xì)胞膜滲透性的變化為評(píng)估植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受力提供了有力證據(jù)[28- 29]。在鹽脅迫條件下,接種根際促生細(xì)菌的黑麥草幼苗葉片相對(duì)質(zhì)膜透性均低于對(duì)照組幼苗,且隨著鹽濃度增加,接種WM13- 24的植株葉片相對(duì)質(zhì)膜透性的上升幅度顯著小于空白和陰性對(duì)照組,與陽性對(duì)照GB03相比,其在降低植物葉片相對(duì)質(zhì)膜透性方面效果也更具優(yōu)勢(shì)。WM13- 24通過抑制鹽脅迫下黑麥草幼苗膜透性的增加,減少電解質(zhì)的外滲,從而維持幼苗細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,有效緩解鹽脅迫對(duì)植株的傷害。

在正常情況下,細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。但植物在遭受逆境脅迫時(shí),這種平衡遭到破壞,活性氧的積累導(dǎo)致膜脂過氧化,嚴(yán)重影響生物膜的功能,造成植株氧化損傷[30- 31]。鹽脅迫下植物體內(nèi)活性氧的積累是導(dǎo)致鹽害的主要原因之一[32]。Chen等[23]發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下,接種解淀粉芽孢桿菌SQR9可通過保護(hù)玉米免受因活性氧積累而造成的損傷及滲透脅迫而賦予其耐鹽性。因此,通過改善植物內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng),及時(shí)清除植物體內(nèi)積累的活性氧,以及降低其滲透勢(shì),可增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性[33]。對(duì)活性氧的清除有兩類防御系統(tǒng),分為酶促和非酶促兩大類,其中酶促類清除劑包括過氧化氫酶(CAT)等[31]。CAT是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶之一,它能清除細(xì)胞內(nèi)過多的活性氧自由基,減少膜質(zhì)的過氧化,進(jìn)而保護(hù)膜的結(jié)構(gòu),從而使植物能在一定程度上抵御逆境脅迫,一般認(rèn)為CAT活性越大,植物的抗逆能力越強(qiáng),故其活性的高低可以反映植物抗逆性[34]。150 mmol/L NaCl和300 mmol/L NaCl處理幼苗2周時(shí),與空白對(duì)照相比,接種WM13- 24顯著提高了幼苗的CAT活性,進(jìn)而提高了黑麥草在鹽脅迫條件下對(duì)活性氧的清除能力;同樣作為膜質(zhì)過氧化的指示化合物的丙二醛(MDA),是由鹽脅迫引起的氧化脅迫造成膜損傷的結(jié)果,因此,MDA含量可用于反映植物遭受逆境損害的程度[35- 38]。在300 mmol/L NaCl處理2周時(shí),接種根際促生細(xì)菌顯著降低了黑麥草幼苗丙二醛含量,說明接種根際細(xì)菌可通過提高CAT等清除劑的活性,及時(shí)清除植物體內(nèi)活性氧,從而減少由鹽逆境引起的氧化脅迫對(duì)植株的傷害。

外界鹽濃度越高植物所遭受的滲透脅迫強(qiáng)度就越大,對(duì)鹽脅迫抗性越強(qiáng)的植物,其滲透勢(shì)下降越快[39]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鹽脅迫條件下WM13- 24顯著降低了黑麥草幼苗的滲透勢(shì),從而有利于維持植株幼苗在脅迫條件下對(duì)水分的吸收。與GB03相比,接種WM13- 24在降低葉片滲透勢(shì)方面效果更顯著。滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)鹽漬等脅迫的主要生理機(jī)制之一,植物在遭受滲透脅迫時(shí),植物能夠合成脯氨酸、可溶性糖等有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來避免細(xì)胞脫水以維持細(xì)胞膨壓,穩(wěn)定細(xì)胞中酶分子的活性構(gòu)象,從而保護(hù)酶免受鹽離子的傷害[40- 42],同時(shí)脯氨酸還可作為自由基的清除劑而保持細(xì)胞膜的完整性[43- 44]。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫條件下接種WM13- 24通過促進(jìn)黑麥草幼苗體內(nèi)對(duì)脯氨酸和可溶性糖的積累,提高了幼苗滲透調(diào)節(jié)能力和抵御鹽脅迫的能力。

在鹽脅迫條件下,植株通過控制其體內(nèi)K+和Na+平衡以保持其正常生長(zhǎng)[45]。植物遭受鹽脅迫時(shí),會(huì)通過主動(dòng)吸收的方式從外界吸收并積累較多無機(jī)鹽離子,如Na+、K+、Mg2+、Cl-等,以調(diào)節(jié)滲透勢(shì)。鉀是植物生長(zhǎng)的必需元素,能夠維持細(xì)胞的基本功能,同時(shí)保持較低水平的蛋白酶和核酸內(nèi)切酶活性并防止植物在鹽脅迫下造成的細(xì)胞損傷和死亡[46]。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)過多Na+的積累會(huì)造成Na+毒害和滲透脅迫,并阻礙植物對(duì)K+的吸收,造成K+匱缺,抑制植物體內(nèi)依賴于K+的生理生化反應(yīng)同時(shí)干擾其他正常生理生化過程,最終導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受到抑制[2, 47-50]。Wang等[51]研究表明,小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)能夠在高濃度Na+環(huán)境下生存,且能夠在體內(nèi)維持較低的Na+濃度,這主要是依靠其對(duì)K+、Na+強(qiáng)大的選擇性吸收能力。隨著NaCl濃度的升高,海濱堿蓬(Suaedamaritima)幼苗體內(nèi)的K+含量會(huì)相應(yīng)的提高,一方面可以維持植物體內(nèi)的K+含量,另一方面還可保持相對(duì)穩(wěn)定的K+/Na+,有利于植物生長(zhǎng)發(fā)育[52]。在鹽脅迫條件下接種枯草芽孢桿菌菌株GB03后擬南芥體內(nèi)Na+含量與未接種對(duì)照相比降低了54%[53];接種菌株GB03還降低了小麥和小花堿茅體內(nèi)Na+的積累并提高了K+/Na+,從而增強(qiáng)二者的耐鹽性[54-55]。本實(shí)驗(yàn)表明在不同濃度的鹽脅迫處理下,接種WM13- 24與GB03均顯著降低了黑麥草幼苗地上部Na+的積累,同時(shí)一定程度增加了地上部K+的含量。并且與GB03相比,WM13- 24更大幅度地降低了根中的Na+水平,在保護(hù)黑麥草免受Na+的毒害作用方面效果更加顯著,同時(shí)維持了根中更高的K+含量,提高了根中的K+/Na+,從而提高了黑麥草的耐鹽性。

綜上所述,兩株根際促生細(xì)菌(WM13- 24和GB03)均維持了多年生黑麥草在鹽脅迫條件下的生長(zhǎng),尤其是分離自梭梭根際的枯草芽孢桿菌WM13- 24效果更佳。接種WM13- 24顯著提高了多年生黑麥草的生物量、葉綠素含量、根系活力、過氧化氫酶活性、可溶性糖、游離脯氨酸含量及地上部鉀/鈉比,降低了丙二醛含量、相對(duì)質(zhì)膜透性、葉片滲透勢(shì),從而提高了多年生黑麥草的耐鹽性。本研究結(jié)果為利用荒漠植物根際促生細(xì)菌提高草類植物耐鹽性和在鹽堿地區(qū)建植牧草和草坪草奠定了一定的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。