李珂嫻，方晶晶,*，江璐，徐新宏，喬江波

1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍特色醫(yī)學(xué)中心，上海 200433 2. 海軍核化安全研究所，北京 100077

惡臭污染是城市生活垃圾處理和工業(yè)發(fā)展中最為普遍和亟待解決的城市環(huán)境問題之一。甲硫醇(CH3SH)屬于一種惡臭化合物，用于制造業(yè)等工業(yè)中，因其具有很強的氣味，可添加到天然氣中，以幫助檢測泄漏。在填埋場的空氣中廣泛檢測到硫化合物，包括甲硫醇(CH3SH)、二甲基硫醚(CH3SCH3)、二甲基二硫醚(CH3SSCH3)和硫化氫(H2S)，這些硫化合物的濃度為1.1～464 μg·m-3，具有一定毒性和刺激性，對人類健康構(gòu)成威脅[1]。甲硫醇在厭氧環(huán)境中產(chǎn)生，在沉積物和垃圾污水中濃度很高。此外，甲硫醇在葡萄酒和奶酪等食品中以低濃度存在。接觸甲硫醇等還原硫化物的工人表現(xiàn)出血紅素合成酶活性降低[2]。一些研究表明，經(jīng)高濃度含硫化合物暴露后，工人患氣流阻塞、刺激性職業(yè)性哮喘的幾率增加了，并有可能因缺血性心臟病而死亡的幾率也有所增加[3]。長時間接觸惡臭污染會影響呼吸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[4]。一旦甲硫醇進入呼吸系統(tǒng)，會直接通過進入血液系統(tǒng)代謝。甲硫醇與紅細胞和蛋白質(zhì)結(jié)合并反應(yīng)生成硫代磺胺嘧啶，該物質(zhì)進一步氧化代謝形成硫代硫酸鹽和硫酸鹽。甲硫醇代謝成硫酸根離子的半衰期約為9.6 h。甲硫醇毒性的決定因素是空氣中的濃度、個體的呼吸速率以及暴露于污染空氣的時間；其高濃度暴露會引起肺損傷，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并導(dǎo)致呼吸中樞系統(tǒng)麻痹，嚴重時引起昏迷和死亡。甲硫醇對呼吸系統(tǒng)的主要毒作用機制是其能夠與細胞色素C氧化酶結(jié)合，并抑制其活性，從而造成細胞的“化學(xué)窒息”。甲硫醇對神經(jīng)系統(tǒng)的毒作用機制主要是抑制腦鈉(Na+)和鉀(K+)-ATPase活性，其神經(jīng)系統(tǒng)毒作用機制與氰化物和硫化氫相似[5]。關(guān)于甲硫醇的毒性研究多集中在高濃度的急性毒作用方面，低濃度亞慢性毒性研究較少。Tansy等[6]將SD大鼠暴露于3.9、33.3和111.7 mg·m-3甲硫醇氣體中3個月，觀察其亞慢性毒性，任何一組均未發(fā)生死亡。最明顯的現(xiàn)象是體重下降和血清生化指標的變化，但臟器的重量沒有變化，暴露后的大鼠氧氣消耗有所下降，病理檢查和切片結(jié)果表明，肺部結(jié)構(gòu)改變，肝臟有結(jié)節(jié)病變，膽小管有炎性細胞，該濃度的慢性暴露對肝功能有一定影響。

本實驗利用低濃度甲硫醇亞慢性暴露模型，進一步觀察甲硫醇染毒后大鼠肺組織的病理學(xué)變化特點，分析暴露對血液生化及肺組織水通道蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達影響，探討甲硫醇低劑量慢性暴露的肺毒性效應(yīng)，為該物質(zhì)對健康損傷的評價及制訂有效防治措施提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 動物暴露模型的制備

實驗開始時選用體重(160±20) g的健康雄性和雌性SD大鼠。SD大鼠隨機分為對照組(C組：雄性n=15，雌性n=15)和甲硫醇暴露組(T組：雄性n=15，雌性n=15)。在(21±1) ℃和50%濕度的環(huán)境下飼養(yǎng)在不銹鋼絲籠內(nèi)(170 mm (W)×294 mm (D)×176 mm (H))，每籠5只大鼠。讓大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，并記錄各組大鼠的初始體重。隨后大鼠在0.6 m3動態(tài)染毒暴露裝置(8050D型，合普工貿(mào)有限公司，天津，中國)中進行甲硫醇染毒實驗。將98 mg·m-3的標準氣瓶(海洲特種氣體有限公司，上海，中國)減壓后用空氣稀釋送入暴露室。用便攜式儀器實時監(jiān)測甲硫醇氣體濃度(Konor JA903型，科爾諾電子科技有限公司，深圳，中國)，甲硫醇暴露濃度為(1.0±0.2) mg·m-3。暴露方案為亞慢性暴露30 d、每天暴露6 h。為了盡量減少暴露期間喂養(yǎng)行為可能帶來的差異，對照組和實驗組在暴露期間被剝奪食物。每組的水供應(yīng)都配備有標準塑料飲水瓶和不銹鋼飲水嘴，在飲水嘴內(nèi)有一鋼球，以便最大限度地減少甲硫醇的溶解。暴露10、20和30 d后分批處死大鼠，收集肺組織和血液樣本。

1.2 試驗方法

1.2.1 肺組織濕干重比

肺濕重與干重之比被用來衡量肺水腫。暴露30 d后采集并稱量大鼠肺右下葉的新鮮組織，并放入80 ℃烘箱中干燥72 h。然后對干燥的組織進行稱重，以確定濕干重量比。

1.2.2 血清生化指標

在多聚甲醛麻醉下，心臟穿刺采集血樣，在4 ℃以4 000 r·min-1離心10 min，所得血清在-20 ℃保存，使用全自動生化分析儀(Advia 2120i，西門子診斷公司，美國)測定小鼠血清18個指標，分別是總蛋白(STP)、白蛋白(ALB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ASTm)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酐(CREA)、尿素(UREA)、葡萄糖(GLU)、尿酸(UA)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(CysC)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)。

1.2.3 肺組織病理切片

切除肺組織并用多聚甲醛溶液快速固定，進行組織病理學(xué)檢查。固定24 h后，將脫水盒放進吊籃里于脫水機內(nèi)進行酒精梯度脫水，將浸好蠟的組織于包埋機內(nèi)進行包埋并于-20 ℃冷凍工作臺(JB-L5，武漢俊杰電子有限公司，中國)冷卻修整。將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚4 μm。攤片機上將組織展平，用載玻片將組織放進60 ℃烘箱內(nèi)烘烤，用蘇木精和伊紅(HE)染色。組織病理學(xué)照片使用光學(xué)顯微鏡(Olympus?BX50，奧林巴斯有限公司，日本)獲得。

1.2.4 肺組織免疫組化染色

通過組織免疫組化染色分析肺組織內(nèi)水通道蛋白(AQP4)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達情況。組織切片置于盛滿乙二胺四乙酸抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中，于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)。自然冷卻后將玻片置于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片放入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。滴加3%牛血清白蛋白(BSA)均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min，在切片上滴加用PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。滴加二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min。切片稍干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的顯色液，自來水沖洗切片終止顯色。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析，陽性為棕黃色，陽性細胞計數(shù)通過ImageJ2X軟件計算(Wayne Rasband，美國國立衛(wèi)生研究院)，取5個獨立的樣本計數(shù)的平均值。

1.2.5 統(tǒng)計分析

暴露組與對照組之間的數(shù)據(jù)首先判斷方差是否均勻或分布是否正態(tài)，方差均勻或分布正態(tài)采用雙尾t檢驗，否則采用非參數(shù)檢驗。分析中使用的軟件是SPSS(version21，IBM Inc.，美國)。如果P<0.05，則認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 肺組織干濕重比

暴露30 d后，肺水腫程度和肺內(nèi)皮通透性由肺濕干重比決定。與對照組相比，暴露組濕干重顯著增加，4組之間比率值不同，如圖1所示。雄性暴露組濕干重比(4.52±0.31)顯著高于雄性對照組(4.09±0.05) (P<0.01)，雌性暴露組濕干重比(7.83±4.47)顯著高于雌性對照組(5.31±0.26) (P<0.05)。

圖1 肺組織的干濕重比(W/D)注：C代表對照組，E代表暴露組；*P<0.05、**P<0.01，n=5。Fig. 1 Wet and dry weight ratio (W/D) of lung tissueNote: C represents control group; E represents exposure group; * P<0.05, ** P<0.01, n=5.

2.2 大鼠血液生化指標

雄性和雌性大鼠的血清生化試驗結(jié)果如表1所示。這些參數(shù)與肝功能、腎功能和心血管功能有關(guān)。亞慢性甲硫醇暴露后，除UREA、GLU、CK-MB和ACE外，各時間點(10、20和30 d)其余血清生化指標水平均無明顯變化。而UREA、GLU、CK-MB和ACE的變化只在10 d和20 d時觀察到，在30 d時沒有發(fā)現(xiàn)對照組和暴露組之間的差異，推斷為生物體自身保護的一種補償性變化。

表1 甲硫醇暴露不同階段SD大鼠血清生化指標水平Table 1 Serum biochemical index values of SD rats at different stages of exposure to methylmercaptan

2.3 組織病理學(xué)研究

對照組肺組織的肺泡囊、肺泡和細支氣管正常，肺泡囊無充血或塌陷的跡象(圖2(a)1、(b)1、(a)2、(b)2、(a)3和(b)3)，暴露組則有明顯變化。大鼠暴露于甲硫醇10 d后，細支氣管出現(xiàn)明顯的杯狀細胞。甲硫醇暴露刺激肺組織，導(dǎo)致細支氣管內(nèi)出現(xiàn)明顯突起的杯狀細胞，終末細支氣管收縮，雖部分肺泡囊仍清晰，肺泡和肺葉間隔可見，但肺泡充血，紅細胞、纖維蛋白和單核細胞滲出，肺泡壁增厚，尤其是在雌性暴露組(圖2(c)1和(d)1)。暴露20 d后，肺泡壁進一步增厚并充滿紅細胞，出現(xiàn)纖維蛋白、單核細胞和少量淋巴細胞滲出物，雌性暴露組情況比雄性暴露組更加嚴重(圖2(c)2和(d)2)。暴露30 d后暴露組的肺泡氣道阻塞，腺體增生，中性粒細胞浸潤、水腫和間質(zhì)浸潤進一步加劇，這與氣管和支氣管周圍大量炎性滲出物有關(guān)，肺泡周圍也觀察到這些滲出物，整體結(jié)論是甲硫醇暴露導(dǎo)致支氣管肺炎和刺激性肺水腫(圖2(c)3和(d)3)。該結(jié)果與肺組織濕干重比變化規(guī)律相對應(yīng)。

圖2 對照組和暴露組肺組織的病理學(xué)特征注：蘇木精-伊紅(H&E)染色(×200)。Fig. 2 Histological appearances of the lung tissue of control and exposure groupsNote: Hematoxylin and eosin (H&E) stain (×200).

2.4 肺組織免疫組化相關(guān)蛋白指標變化

免疫組化法結(jié)果如圖3所示，甲硫醇亞慢性暴露后，大鼠肺組織中AQP4表達水平明顯下調(diào)，所有暴露組與對照組均有顯著性差異(n=5，*P<0.05)，甲硫醇亞慢性暴露影響AQP4表達，從而進一步影響肺內(nèi)液體轉(zhuǎn)運及血氣屏障通透性。甲硫醇亞慢性暴露30 d后大鼠肺組織MMP-9表達水平明顯上調(diào)，所有暴露組和對照組均有顯著性差異(n=5，*P<0.05)。

圖3 暴露30 d后肺組織中AQP4和MMP-9的變化(×200)及定量分析注：*P<0.05、**P<0.01，n=5。Fig. 3 Changes of AQP4 and MMP-9 in lung tissue (×200) and quantitative analysis after 30 d of exposureNote: * P<0.05,** P<0.01, n=5.

3 討論(Discussion)

水通道蛋白(AQPs)是一種位于細胞膜上的蛋白質(zhì)(內(nèi)在膜蛋白)，在細胞膜上組成“孔道”，可控制水在細胞中的進出，是廣泛分布于動植物細胞膜上的具有高度選擇性的水通道特異小分子跨膜蛋白質(zhì)家族。AQPs廣泛分布于機體組織細胞中，參與水的分泌、吸收及細胞內(nèi)外水的平衡。而器官的許多生理功能都有水分子的參與，同時許多臟器疾病如肺水腫涉及肺內(nèi)水運動平衡的紊亂[7]。血氣屏障及肺表面活性物質(zhì)是肺內(nèi)液體轉(zhuǎn)運的屏障。肺泡與肺部毛細血管緊密相連，由肺泡表面液體層、Ⅰ型肺泡細胞與基膜、薄層結(jié)締組織、毛細血管基膜與內(nèi)皮組成血氣屏障，有助于氣體快速擴散；肺表面活性物質(zhì)由肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌，是一種復(fù)雜的脂蛋白，分布于肺泡液體分子層表面，具有降低肺泡表面張力的作用，能維持大小肺泡容量的相對穩(wěn)定，阻止肺泡毛細血管中液體向肺泡內(nèi)濾出至肺組織中。因此，肺組織內(nèi)血氣屏障的存在與肺泡表面活性物質(zhì)一起構(gòu)成了肺內(nèi)液體轉(zhuǎn)運的屏障，保護肺組織免受損傷。AQPs的表達還受生長因子、炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)。病毒感染致肺炎及脂多糖致肺損傷時，肺組織中AQP1和AQP5表達下調(diào)，AQPs參與水或其他分子跨膜轉(zhuǎn)運的分子生物學(xué)機制是參與肺水調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)[8-10]。各種肺損傷及肺內(nèi)積液常伴有肺內(nèi)水運動的紊亂及AQPs的改變，因此，研究水通道蛋白與肺臟疾病及肺內(nèi)水運動的平衡關(guān)系對毒物暴露效應(yīng)具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧時星形膠質(zhì)細胞內(nèi)AQP4表達較對照組明顯減少，而復(fù)氧后蛋白表達升高并因時間延長明顯增加[11]。Yamamoto等[12]也有相似的研究結(jié)果，缺氧條件下，星形膠質(zhì)細胞內(nèi)AQP4蛋白的表達減少低于正常表達。甲硫醇暴露組大鼠AQP4表達顯著降低，由此推測，暴露導(dǎo)致肺部產(chǎn)生缺氧環(huán)境，在此條件下，AQP4蛋白的表達減少，導(dǎo)致了肺泡-毛細血管間水轉(zhuǎn)運障礙，可能進一步導(dǎo)致液體在肺泡腔、肺間質(zhì)的積聚。

細胞外基質(zhì)(ECM)位于上皮或內(nèi)皮細胞下層或結(jié)締組織細胞周圍，為組織、器官甚至機體的完整性提供支持并參與相關(guān)生理活動，其成分主要是一些多糖和蛋白質(zhì)，或蛋白多糖。ECM除了具有連接、支持、保水、抗壓及保護等物理學(xué)作用，在細胞的基本生命活動中發(fā)揮著全方位的生物學(xué)作用。ECM組成的變化常常與疾病的發(fā)生發(fā)展有緊密聯(lián)系[13-15]。氣道基底膜增厚是哮喘氣道重塑的特征性改變，肺組織上皮的ECM蛋白大量沉積是哮喘氣道重塑的重要組成部分?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組Zn或Ca依賴的ECM降解酶。MMPs對降解細胞外基質(zhì)有著主導(dǎo)作用。MMPs在支氣管哮喘患者氣道炎癥及組織重塑中發(fā)揮重要作用。許多研究者對支氣管哮喘患者的誘導(dǎo)痰液、支氣管肺泡灌洗液(BALF)、肺活檢標本以及體外培養(yǎng)的巨噬細胞進行了MMPs檢測分析，其MMP-9產(chǎn)生明顯增高。MMP-9主要來源于嗜酸細胞、巨噬細胞和中性粒細胞。MMP-9可降解Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白等ECM，MMP-9正常釋放可以維持ECM穩(wěn)定[16]。若其比例失衡，則ECM沉積使上皮下纖維化[17]。Barbaro等[18]通過研究呼出氣冷凝液中MMP-9表達與第一秒用力呼氣容積等的相關(guān)性證實，MMP-9在不同的哮喘表型中有不同程度的釋放，隨哮喘及氣道重塑的加重而增加并在哮喘急性發(fā)作時表達進一步增加，可作為哮喘持續(xù)氣道重塑的標志物。MMP-9表達與哮喘患者肺功能成負相關(guān)，提示MMP-9可用于評估哮喘嚴重程度、監(jiān)測氣道重塑。哮喘早期也可通過檢測MMP-9來評估氣道重塑，并作為哮喘預(yù)測性生物標志物。免疫組化法結(jié)果顯示，甲硫醇亞慢性暴露30 d后大鼠肺組織和海馬組織中MMP-9表達水平明顯上調(diào)。肺組織病理切片和濕干重比變化規(guī)律和上述結(jié)果相互印證，肺組織切片可觀察到支氣管、血管周圍炎性細胞浸潤，暴露誘導(dǎo)了氣道/肺部炎癥。中性粒細胞分泌氧自由基、炎癥因子、炎癥介質(zhì)和各類蛋白酶，包括彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等，可促進炎癥形成和肺泡破壞。上述這些結(jié)果提示了毒物進一步引發(fā)肺氣腫或者哮喘等呼吸道疾病的可能性。

低濃度甲硫醇亞慢性暴露對大鼠肺組織的產(chǎn)生一定損害，濕干重比顯著增加，組織損傷程度隨暴露時間增加呈現(xiàn)加重趨勢，肺泡氣道阻塞，腺體增生，中性粒細胞浸潤、水腫和間質(zhì)浸潤進一步加劇，暴露組的氣管和支氣管周圍有大量炎性滲出物，暴露組的肺組織中AQP4表達下調(diào)，MMP-9表達上調(diào)，提示暴露可能導(dǎo)致肺氣腫或者哮喘等呼吸道疾病。

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