孫玉瑩，趙 佳，王玉婷，李俊杰，曲 崳，何文森

(1.江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2.豐益油脂科技(連云港)有限公司，江蘇 連云港 222042)

植物甾醇主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇4種，廣泛存在于植物油、堅果等植物性食物中。植物甾醇化學(xué)結(jié)構(gòu)與膽固醇類似，具有顯著的降膽固醇功效。然而，植物甾醇的熔點高、油溶性差，極大地限制了其實際應(yīng)用。為了改善植物甾醇的油溶性，許多學(xué)者以脂肪酸或植物油為親油修飾劑合成植物甾醇脂肪酸酯[1-2]。常見的親油修飾劑包括棕櫚酸[3]、油酸[4]、亞油酸[5]、共軛亞油酸[6]、亞麻酸、大豆油、葵花籽油等[7]。經(jīng)酯化修飾后，植物甾醇的油溶性得到了明顯的改善。這些修飾劑均是長鏈脂肪酸或相應(yīng)的甘油三酯，長期大量攝入會引起高血脂。相比之下，中鏈脂肪酸進(jìn)入消化道后可直接通過門靜脈進(jìn)入肝臟，迅速地提供能量，不會增加肝臟負(fù)擔(dān)，可有效預(yù)防心血管疾病的發(fā)生[8]。因此，中鏈脂肪酸受到了越來越多的關(guān)注。正辛酸是一種含8個碳原子的典型中鏈脂肪酸，目前鮮有催化合成植物甾醇正辛酸酯的報道。

合成植物甾醇酯的方法主要包括化學(xué)法、酶法。酶法因具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高、綠色環(huán)保等優(yōu)點而備受關(guān)注。目前，用于催化植物甾醇酯合成的脂肪酶主要包括Novozym 435、Candidarugosa、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM等[7]。Candidasp.99-125是一種新型脂肪酶，已被廣泛用于催化各種酯化、酯交換等反應(yīng)[9]。迄今為止，尚無利用Candidasp.99-125脂肪酶催化合成植物甾醇正辛酸酯的報道。本文首次以Candidasp.99-125脂肪酶為催化劑，以正辛酸為修飾劑，以β-谷甾醇作為植物甾醇的代表，催化合成β-谷甾醇正辛酸酯，以改善其油溶性。利用薄層色譜、核磁共振波譜對產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，利用高效液相色譜對產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行定量分析，通過單因素試驗優(yōu)化了產(chǎn)物的合成工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

β-谷甾醇(純度>95%)，西安百川生物科技有限公司；正辛酸(純度>95%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Candidasp.99-125脂肪酶(酶活20 000 U/g)，北京凱泰新世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

THZ-92B氣浴恒溫振蕩器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份公司；LC-20A型液相色譜儀，日本島津公司；蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)，德國珊貝克公司；AvanceⅡ核磁共振儀(400 MHz)，瑞士Bruker公司；NETZSCH DSC 204 F1型動態(tài)熱流式差示掃描量熱儀，德國耐馳公司。

1.2 試驗方法

1.2.1β-谷甾醇正辛酸酯的合成

分別稱取一定量的β-谷甾醇、正辛酸、Candidasp.99-125脂肪酶、3?分子篩于20 mL棕色小瓶內(nèi)，加入一定體積的反應(yīng)溶劑，置于提前預(yù)熱的氣浴恒溫振蕩器中反應(yīng)一段時間。每隔12 h取樣一次，每次取樣200 μL，保存待測。

1.2.2 薄層色譜分析

提前配制好正辛酸、β-谷甾醇、反應(yīng)液。用毛細(xì)管吸取10 μL樣品均勻點樣在硅膠薄層色譜板上，邊點樣邊用吹風(fēng)機(jī)吹干。點樣完成后，將薄層板置于層析缸中展開。展開劑為石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(體積比8∶2)，充分展開后，放入烘箱中烘干，在碘缸中顯色約30 min，取出觀察顯色情況。組分在薄層板上不同的位置，可用比移值(Rf)表示。

Rf=L1/L2

(1)

式中：L1為組分位置至點樣原點中心的距離；L2為溶劑前沿至點樣原點中心的距離。

1.2.3 硅膠柱層析分離純化

將1.2.1中反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，得β-谷甾醇正辛酸酯粗品。取出約200 mL 200～300目的柱層析硅膠放入燒杯，加入一定洗脫劑浸泡一段時間，緩慢裝入擴(kuò)口層析柱。將一定量的β-谷甾醇正辛酸酯粗品溶于5 mL洗脫劑，緩慢加入硅膠柱中。用石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(體積比8∶2)洗脫劑進(jìn)行洗脫，用試管收集洗脫液。利用薄層色譜檢測產(chǎn)物，收集只含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，經(jīng)旋蒸、干燥得β-谷甾醇正辛酸酯純品。

1.2.4 核磁共振波譜分析

將β-谷甾醇正辛酸酯純品溶于氘代氯仿(CDCl3)，用于核磁共振波譜分析。四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)物，CDCl3作為溶劑，1H譜頻率為400 MHz，13C譜和DEPT-135譜的頻率為100 MHz。

1.2.5 熔點測試

利用差示掃描量熱儀(DSC)測定β-谷甾醇、β-谷甾醇正辛酸酯純品的熔點。分別稱取5 mg樣品均勻平鋪于鋁制坩堝底部，以空白坩堝作對照。分析條件為初始溫度20 ℃，以10 ℃/min的速率升溫至180℃。

1.2.6 高效液相色譜定量分析

將反應(yīng)液用無水乙醇溶解(反應(yīng)液與無水乙醇體積比為0.1∶1)，經(jīng)有機(jī)濾膜過濾后注入玻璃樣品瓶，進(jìn)行高效液相色譜分析。分析條件：Symmetry C18色譜柱(5 μm, 4.6 mm×150 mm，Waters)，柱溫35℃，流動相為甲醇-異丙醇-正己烷(體積比7.8∶1.1∶1.1)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，ELSD溫度35℃，氮?dú)庾鳛檩d氣，壓力0.05 MPa。采用面積歸一化法計算轉(zhuǎn)化率(x)。

x=S1/(S1+S2)×100%

(2)

式中：S1為產(chǎn)物峰面積；S2為β-谷甾醇峰面積。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件處理，組間各指標(biāo)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)”的形式表示，不同的字母代表差異顯著(p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 薄層色譜層析圖

圖1為β-谷甾醇、正辛酸、反應(yīng)液及產(chǎn)物的薄層色譜圖。

注：1.β-谷甾醇；2.正辛酸；3.反應(yīng)液；4.β-谷甾醇正辛酸酯。

由圖1可知，β-谷甾醇的Rf為0.4～0.5，正辛酸的Rf為0.8～0.9，產(chǎn)物β-谷甾醇正辛酸酯的Rf接近1.0。通常，Rf越小，極性越強(qiáng)，反之越弱。說明β-谷甾醇正辛酸酯的極性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于β-谷甾醇。圖1說明合成了目標(biāo)產(chǎn)物，且產(chǎn)物與底物可以很好地分離開來。

2.2 核磁共振波譜圖

產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其1H、13C、DEPT-135核磁共振波譜分析結(jié)果如圖2～圖4所示。通過積分，氫譜上共有64個氫原子，正好與β-谷甾醇正辛酸酯分子結(jié)構(gòu)上氫原子數(shù)目一致(見圖2)。其中，化學(xué)位移4.5～4.7之間的多重峰對應(yīng)于3位CH上氫原子，化學(xué)位移5.3～5.4之間的峰為6位CH上氫原子的波譜吸收信號(見圖3)。

圖2 β-谷甾醇正辛酸酯結(jié)構(gòu)式

圖3 β-谷甾醇正辛酸酯的1H NMR譜圖

圖4 β-谷甾醇正辛酸酯的13C、DEPT-135 NMR譜圖

通常，13C譜上出現(xiàn)測試樣品中所有的碳原子，而DEPT-135譜可以區(qū)分不同類型的碳原子。本文中，13C譜上總共出現(xiàn)了37個碳，與β-谷甾醇正辛酸酯分子式碳原子數(shù)目一致(見圖2)。在DEPT-135譜中，季碳不會出現(xiàn)，伯碳(CH3)、叔碳(CH)的信號峰朝上，而仲碳(CH2)的信號峰朝下。由圖4可知，與13C譜相比，DEPT-135譜少了4個峰，對應(yīng)于β-谷甾醇正辛酸酯分子結(jié)構(gòu)上的4個季碳。其中，化學(xué)位移173.2對應(yīng)于1′羰基碳；化學(xué)位移139.7對應(yīng)于5位碳；化學(xué)位移42.3和37.0分別對應(yīng)10位和13位碳。DEPT-135譜中有17個朝下的峰，正好與β-谷甾醇正辛酸酯分子結(jié)構(gòu)上亞甲基數(shù)目一致(見圖2)?；瘜W(xué)位移73.6和122.6分別對應(yīng)于3位和6位CH的碳原子。綜上，目標(biāo)產(chǎn)物為β-谷甾醇正辛酸酯。

2.3 熔點

β-谷甾醇和β-谷甾醇正辛酸酯的DSC曲線如圖5所示。

圖5 β-谷甾醇、β-谷甾醇正辛酸酯的DSC曲線

由圖5可知，β-谷甾醇的熔點為139℃，而β-谷甾醇正辛酸酯的熔點僅為63℃。β-谷甾醇經(jīng)與正辛酸酯化后，其熔點顯著降低，有助于拓寬植物甾醇的應(yīng)用范圍。

2.4 高效液相色譜圖

圖6為底物混合物(β-谷甾醇、正辛酸)、反應(yīng)液的高效液相色譜圖。

圖6 底物混合物、反應(yīng)液高效液相色譜圖

由圖6可知，正辛酸的保留時間為2.3 min，β-谷甾醇的保留時間為6.2 min。與底物混合物相比，反應(yīng)液在18 min多了一個色譜峰，對應(yīng)為產(chǎn)物β-谷甾醇正辛酸酯。圖6說明可以用高效液相色譜法對目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。

2.5 反應(yīng)工藝參數(shù)的確定

2.5.1 溶劑種類

反應(yīng)溶劑是影響酶催化反應(yīng)的重要因素之一。一方面，反應(yīng)溶劑可以通過改變底物的溶解度來影響反應(yīng)體系的傳質(zhì)；另一方面，反應(yīng)溶劑可以通過改變脂肪酶的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響酶的活性和穩(wěn)定性。正己烷、異辛烷是非水相脂肪酶催化酯化、酯交換反應(yīng)常用的兩種溶劑[2, 10-11]，其對產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響如圖7所示。

注：反應(yīng)條件為50 mmol/L β-谷甾醇，50 mmol/L 正辛酸，20 mg/mL脂肪酶，120 mg/mL 3?分子篩，5 mL溶劑，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時間12 h。圖中不同的字母代表具有顯著性差異(p<0.05)，下同。

由圖7可知，異辛烷作為反應(yīng)溶劑，轉(zhuǎn)化率達(dá)到77.9%，明顯高于正己烷(34.2%)。原因為：通常有機(jī)溶劑極性越強(qiáng)，對酶的結(jié)構(gòu)影響越大，從而降低轉(zhuǎn)化率；反之，有利于提高轉(zhuǎn)化率。一方面，異辛烷的疏水性較正己烷強(qiáng)，前者有利于維持脂肪酶原有的構(gòu)象，從而表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)化率。另一方面，異辛烷的疏水性強(qiáng)，產(chǎn)物β-谷甾醇正辛酸酯極性較弱，故產(chǎn)物在異辛烷中有很好的溶解度，這也有利于使反應(yīng)向酯合成方向進(jìn)行。因此，最終選擇異辛烷為反應(yīng)溶劑。

2.5.2 反應(yīng)溫度

反應(yīng)溫度是影響酯化反應(yīng)的主要因素，可能通過兩方面影響反應(yīng)。一方面，溫度可以影響底物在溶劑中的溶解度；另一方面，溫度與脂肪酶的活性、穩(wěn)定性密切相關(guān)[12]。圖8是反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)化率的影響。

注：反應(yīng)條件為50 mmol/L β-谷甾醇，50 mmol/L 正辛酸，20 mg/mL脂肪酶，120 mg/mL 3?分子篩，5 mL異辛烷，反應(yīng)時間12 h。

由圖8可知：反應(yīng)溫度為35℃時轉(zhuǎn)化率較低，不到30%；隨著反應(yīng)溫度的升高，轉(zhuǎn)化率逐漸升高，當(dāng)反應(yīng)溫度升高到45℃時轉(zhuǎn)化率達(dá)到了90%；反應(yīng)溫度進(jìn)一步升高至50℃和55℃，轉(zhuǎn)化率無明顯變化。這表明Candidasp.99-125脂肪酶催化該反應(yīng)的最適溫度是45℃。

2.5.3 脂肪酶用量

脂肪酶用量對轉(zhuǎn)化率的影響如圖9所示。

注：反應(yīng)條件為50 mmol/L β-谷甾醇，50 mmol/L 正辛酸，120 mg/mL 3?分子篩，5 mL異辛烷，反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)時間12 h。

由圖9可知：當(dāng)脂肪酶用量從10 mg/mL 上升到20 mg/mL時，β-谷甾醇的轉(zhuǎn)化率明顯增加，轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.3%；當(dāng)脂肪酶用量進(jìn)一步增加時，轉(zhuǎn)化率雖略有增加但無顯著變化。這表明對該反應(yīng)而言，Candidasp.99-125 脂肪酶用量為20 mg/mL時已達(dá)到飽和，繼續(xù)增加其用量并不能促進(jìn)酯化反應(yīng)進(jìn)行。萬曉紅[13]在利用Candidasp.99-125脂肪酶催化合成環(huán)氧油酸酯時也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。因此，選擇脂肪酶用量為20 mg/mL。

2.5.4 底物摩爾比

β-谷甾醇和正辛酸分別為一元醇和一元酸。理論上講，等摩爾β-谷甾醇與正辛酸是最理想的摩爾比。然而，酯化反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)，難以完全朝著酯合成方向進(jìn)行，適當(dāng)提高其中一種底物的用量，可以促進(jìn)另一種底物轉(zhuǎn)化[12]。β-谷甾醇與正辛酸摩爾比對轉(zhuǎn)化率的影響如圖10所示。

注：反應(yīng)條件為50 mmol/L β-谷甾醇，20 mg/mL脂肪酶，120 mg/mL 3?分子篩，5 mL異辛烷，反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)時間12 h。

由圖10可知：當(dāng)β-谷甾醇過量即β-谷甾醇與正辛酸摩爾比為1∶0.5時，轉(zhuǎn)化率低于75%；當(dāng)β-谷甾醇與正辛酸摩爾比為1∶1時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了90%以上；正辛酸用量繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)化率下降。以前的研究表明，適當(dāng)增加脂肪酸可以促進(jìn)植物甾醇酯的合成[12]。然而，本研究中等摩爾比時轉(zhuǎn)化率最大，當(dāng)酸過量時轉(zhuǎn)化率反而下降。這可能是由于以前合成植物甾醇酯時大多選用長鏈脂肪酸為?；w，而本研究選用正辛酸為?；w。一般而言，脂肪酸碳鏈越長，極性越弱；反之，極性越強(qiáng)。當(dāng)極性強(qiáng)的脂肪酸增多時，會破壞脂肪酶的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降。因此，選擇β-谷甾醇與正辛酸的最適摩爾比為1∶1。

2.5.5 底物濃度

底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響如圖11所示。

注：反應(yīng)條件為β-谷甾醇與正辛酸摩爾比1∶1，20 mg/mL 脂肪酶，120 mg/mL 3?分子篩，5 mL異辛烷，反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)時間12 h。

由圖11可知，β-谷甾醇濃度在25 mmol/L時，轉(zhuǎn)化率幾乎達(dá)到了95%，這可能是由于脂肪酶Candidasp.99-125相對底物而言過量，足以使得β-谷甾醇反應(yīng)完全。進(jìn)一步增加β-谷甾醇濃度至50 mmol/L，轉(zhuǎn)化率略有下降，β-谷甾醇濃度增加至75 mmol/L，轉(zhuǎn)化率急速下降。這可能是由于在較高濃度下，大多數(shù)底物在有機(jī)溶劑中不溶解。因此，綜合考慮轉(zhuǎn)化率和β-谷甾醇濃度的關(guān)系，并從提高生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本的角度考慮，選擇50 mmol/L作為反應(yīng)最適的底物濃度。

2.5.6 反應(yīng)時間

反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響如圖12所示。

注：反應(yīng)條件為50 mmol/L β-谷甾醇，50 mmol/L正辛酸，20 mg/mL脂肪酶，120 mg/mL 3?分子篩，5 mL異辛烷，反應(yīng)溫度45℃。

由圖12可知：2～12 h內(nèi)，轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時間的延長呈上升趨勢；12～24 h內(nèi)，轉(zhuǎn)化率沒有明顯變化；反應(yīng)12 h產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率已經(jīng)達(dá)到90%以上。因此，選擇12 h作為最適反應(yīng)時間。

3 結(jié) 論

本文首次利用Candidasp.99-125脂肪酶催化合成β-谷甾醇正辛酸酯。利用薄層色譜、核磁共振波譜、差式掃描量熱分析、高效液相色譜對產(chǎn)物進(jìn)行分析與表征，證實合成產(chǎn)物為β-谷甾醇正辛酸酯，β-谷甾醇經(jīng)與正辛酸酯化后熔點顯著降低。通過單因素試驗考察了溶劑種類、反應(yīng)溫度、脂肪酶用量、底物摩爾比、底物濃度、反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明：以20 mg/mLCandidasp.99-125脂肪酶為催化劑，5 mL異辛烷，50 mmol/Lβ-谷甾醇，β-谷甾醇與正辛酸摩爾比1∶1，120 mg/mL 3?分子篩，45℃下反應(yīng)12 h，轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%以上。