侯 靖，王 澍，盧躍鵬，劉夢(mèng)婷，周瑋婧

(武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，武漢 430012)

橄欖油是從橄欖果實(shí)中榨取的油脂，具有獨(dú)特的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效，市場(chǎng)潛力巨大。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23347—2009對(duì)橄欖油進(jìn)行了嚴(yán)格的等級(jí)劃分。低質(zhì)量的橄欖油，甚至油橄欖果渣油通過適當(dāng)?shù)奶幚砜梢越档退醿r(jià)以及除去不良風(fēng)味，從而冒充或摻入特級(jí)初榨橄欖油進(jìn)行銷售。相較于摻入其他油脂，這種摻假方式更加不容易被發(fā)現(xiàn)。

脂肪酸烷基酯是游離脂肪酸與橄欖果發(fā)酵產(chǎn)生的低級(jí)醇類反應(yīng)產(chǎn)生的，主要有脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯，使用的橄欖果保存不當(dāng)可導(dǎo)致脂肪酸烷基酯含量過高[1]。Pérez-Camino等[2]發(fā)現(xiàn)原產(chǎn)地西班牙的特級(jí)初榨橄欖油中脂肪酸烷基酯含量均低于40 mg/kg，脂肪酸乙酯與脂肪酸甲酯含量的平均比值為1.0，而橄欖燈油中脂肪酸烷基酯含量高于70 mg/kg，脂肪酸乙酯與脂肪酸甲酯含量的平均比值大于5.0。脂肪酸烷基酯含量與感官缺陷具有相關(guān)性，有發(fā)酵缺陷的橄欖油中脂肪酸烷基酯的含量較高[3-4]。低溫精煉無法降低橄欖油中脂肪酸烷基酯含量，因此可以用其作為經(jīng)過低溫精煉的低品質(zhì)橄欖油冒充或摻入特級(jí)初榨橄欖油的鑒別指標(biāo)。國際橄欖油協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)COI/T.15/NC No 3/Rev. 14-2019規(guī)定特級(jí)初榨橄欖油中脂肪酸乙酯含量不得超過35 mg/kg。相對(duì)于低溫精煉技術(shù)，高溫精煉可以降低油脂的酸價(jià)[5]以及脂肪酸烷基酯含量[6]。但是高溫精煉會(huì)使油脂中的β-谷甾醇脫水產(chǎn)生豆甾二烯，用該指標(biāo)可以敏感地發(fā)現(xiàn)初榨橄欖油中摻入精煉油脂[7-10]，國際橄欖油協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定特級(jí)初榨橄欖油中豆甾二烯含量不得超過0.05 mg/kg。

橄欖油中脂肪酸烷基酯含量的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[11]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]，相對(duì)于氣相色譜法，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法有更低的定量限和更好的抗干擾能力，從而可以簡化前處理步驟，提高檢測(cè)通量。豆甾二烯含量常見的檢測(cè)方法有液相色譜法[13-14]、氣相色譜法[15]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16]，相比之下，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法除了可以提供更好的靈敏度外，也有更好的定性能力。

對(duì)于脂肪酸烷基酯與豆甾二烯，目前文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法普遍采用自行填裝的硅膠層析柱，檢測(cè)較為費(fèi)時(shí)。本文報(bào)道一種采用商品化硅膠柱，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速檢測(cè)橄欖油中豆甾二烯含量的方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期建立的橄欖油中脂肪酸烷基酯含量的檢測(cè)方法[17]，對(duì)34份市售橄欖油進(jìn)行檢測(cè)。通過對(duì)橄欖油中上述兩個(gè)指標(biāo)的綜合分析，對(duì)市售不同等級(jí)橄欖油品質(zhì)進(jìn)行研究，為日后風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)制修訂提供技術(shù)支持與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

特級(jí)初榨橄欖油、混合橄欖油及混合油橄欖果渣油，購于京東、淘寶及武漢市場(chǎng)。正己烷，色譜純，德國Merck公司；無水乙醚、無水硫酸鈉，分析純，國藥試劑；棕櫚酸甲酯(純度>99%)、十七烷酸甲酯(純度>99%)、硬脂酸甲酯(純度>99%)、棕櫚酸乙酯(純度>99%)、硬脂酸乙酯(純度>99%)、油酸乙酯(純度>99%)、亞油酸乙酯(純度>99%)，ANPEL；油酸甲酯(純度>99 %)、亞油酸甲酯(純度>99%)、豆甾-3,5-二烯(純度>95%)，加拿大TRC公司；膽甾-3,5-二烯(純度>93%)，美國Sigma公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)，Vortex-Genie 2 渦旋混勻器(美國Scientific Industries公司)，N-EVAP111氮?dú)鉂饪s儀(美國Organomation Associates Jnc. 公司)，DB-5MS 色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司)，硅膠固相萃取柱(1 000 mg，美國Waters公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1.1 脂肪酸烷基酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯和亞油酸乙酯各100 mg于100 mL容量瓶中，加入正己烷定容，得質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的脂肪酸烷基酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，加入正己烷定容，得質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的脂肪酸烷基酯標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.1.2 十七烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精確稱取十七烷酸甲酯100 mg于100 mL容量瓶中，加入正己烷定容，得質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的十七烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。移取1 mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，加入正己烷定容，得質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的十七烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.1.3 豆甾二烯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取豆甾-3,5-二烯2.50 mg于10 mL容量瓶中，加入正己烷定容，得質(zhì)量濃度為250 μg/mL的豆甾二烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，加入正己烷定容，得質(zhì)量濃度為2.50 μg/mL的豆甾二烯標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.1.4 膽甾二烯內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精確稱取膽甾-3,5-二烯5.00 mg于10 mL容量瓶中，加入正己烷定容，得質(zhì)量濃度為500 μg/mL的膽甾二烯內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。移取1 mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，加入正己烷定容，得質(zhì)量濃度為5.00 μg/mL的膽甾二烯內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2 脂肪酸烷基酯含量的測(cè)定[17]

1.2.2.1 樣品前處理

精密稱取0.1 g油脂樣品于10 mL離心管中，加入100 μL十七烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液，再加入0.8 mL正己烷溶解樣品。硅膠固相萃取柱使用6 mL正己烷活化，當(dāng)正己烷液面與硅膠層頂端相切時(shí)，將樣品溶液加入固相萃取柱中；樣品溶液液面與硅膠層頂端相切時(shí)再加入10 mL正己烷-乙醚(體積比99∶1)進(jìn)行洗脫。收集流出液，氮?dú)庀戮徛蹈?，加? mL正己烷復(fù)溶，供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。

1.2.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

氣相色譜條件：DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度300℃；載氣為高純氦氣(純度>99.999%)，流速1.0 mL/min；升溫程序?yàn)?00℃保持1 min，以20℃/min升至200℃，保持1 min，再以5℃/min升至240℃，最后以20℃/min升至300℃，保持2 min；傳輸線溫度300℃。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊源(EI)，電離能量70 eV，離子源溫度270℃，溶劑延遲時(shí)間8 min，監(jiān)測(cè)方式為選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)。

8種脂肪酸烷基酯及內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 8種脂肪酸烷基酯及內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

1.2.3 豆甾二烯含量的測(cè)定

1.2.3.1 樣品前處理

精確稱取0.1 g油脂樣品于10 mL離心管中，加入20 μL膽甾二烯內(nèi)標(biāo)溶液，再加入0.9 mL正己烷溶解樣品。硅膠固相萃取柱上加入1 cm高無水硫酸鈉，加入6 mL正己烷活化；當(dāng)正己烷液面與無水硫酸鈉層頂端相切時(shí)，將樣品溶液加入固相萃取柱中；樣品溶液液面與無水硫酸鈉層頂端相切時(shí)再加入10 mL正己烷進(jìn)行洗脫。收集流出液，氮?dú)庀戮徛蹈桑尤?.2 mL正己烷復(fù)溶，供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。

1.2.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

氣相色譜條件：DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度300℃；載氣為高純氦氣(純度>99.999%)，流速1.0 mL/min；升溫程序?yàn)?00℃保持1 min，以30℃/min升至280℃，再以5℃/min升至300℃，保持5 min；傳輸線溫度300℃。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊源(EI)，電離能量70 eV，離子源溫度230℃，溶劑延遲時(shí)間8 min，監(jiān)測(cè)方式為選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)。

豆甾二烯及內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 豆甾二烯及內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 豆甾二烯和膽甾二烯的總離子流圖

采用DB-5MS色譜柱，在1.2.3.2氣相色譜-質(zhì)譜條件下，豆甾二烯及內(nèi)標(biāo)物膽甾二烯的總離子流圖如圖1所示。

圖1 豆甾二烯及膽甾二烯的總離子流圖

由圖1可知，豆甾二烯及膽甾二烯峰型良好，二者可完全分離。

2.2 豆甾二烯含量測(cè)定前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

向空白樣品中(未檢出豆甾二烯的特級(jí)初榨橄欖油)加入豆甾二烯標(biāo)準(zhǔn)溶液制備加標(biāo)樣品，按1.2.3.1 所述前處理步驟操作，選擇正己烷以及正己烷-乙醚(體積比99∶1)進(jìn)行洗脫試驗(yàn)。結(jié)果表明，10 mL正己烷即可將豆甾二烯及內(nèi)標(biāo)膽甾二烯完全洗脫，而用正己烷-乙醚(體積比99∶1)進(jìn)行洗脫，在檢測(cè)時(shí)有干擾存在，故選擇10 mL正己烷作為洗脫液進(jìn)行洗脫。

2.3 豆甾二烯含量檢測(cè)方法驗(yàn)證

2.3.1 檢出限、定量限與線性范圍

稱取0.1 g未檢出豆甾二烯的特級(jí)初榨橄欖油樣品，加入40 μL經(jīng)10倍稀釋后的豆甾二烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備0.1 mg/kg的加標(biāo)樣品，經(jīng)處理后按1.2.3.2條件進(jìn)行檢測(cè)，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，10倍信噪比計(jì)算定量限。在豆甾二烯0.05 ～2.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，以豆甾二烯與內(nèi)標(biāo)膽甾二烯的相對(duì)質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，相對(duì)峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制曲線并進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程。豆甾二烯的檢出限、定量限、回歸方程與線性范圍見表3。

表3 豆甾二烯的檢出限、定量限、回歸方程與線性范圍

由表3可知，豆甾二烯的檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.10 mg/kg，在0.05 ～2.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 回收率與精密度

稱取0.1 g未檢出豆甾二烯的特級(jí)初榨橄欖油樣品，分別加入40、120 μL經(jīng)10倍稀釋后的豆甾二烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及40 μL豆甾二烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成0.10、0.30、1.0 mg/kg的加標(biāo)樣品。3個(gè)加標(biāo)樣品各5份，經(jīng)處理后采用1.2.3.2條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算豆甾二烯的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表4。

表4 豆甾二烯的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

由表4可知，豆甾二烯的回收率為98.05%～100.19%，RSD小于等于3.04%。

2.4 實(shí)際樣品中脂肪酸烷基酯與豆甾二烯含量

實(shí)際樣品中脂肪酸烷基酯與豆甾二烯含量見表5。

表5 實(shí)際樣品中脂肪酸烷基酯與豆甾二烯含量

由表5可知，26份標(biāo)稱為特級(jí)初榨橄欖油的樣品中，有3份樣品檢出豆甾二烯含量大于0.05 mg/kg，不符合國際橄欖油協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，提示有經(jīng)高溫精煉或摻入精煉油脂的可能。6份混合橄欖油中豆甾二烯的含量在10.68～70.69 mg/kg之間，混合油橄欖果渣油中豆甾二烯的含量更高達(dá)186.14～200.18 mg/kg，說明不同等級(jí)橄欖油與油橄欖果渣油中豆甾二烯含量差異明顯。26份標(biāo)稱為特級(jí)初榨橄欖油的樣品中，有5份樣品中脂肪酸乙酯含量超過國際橄欖油協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)中特級(jí)初榨橄欖油35 mg/kg的限量，且含量最高的26號(hào)樣品與6號(hào)樣品中脂肪酸乙酯與脂肪酸甲酯的比值分別為2.86和2.41，遠(yuǎn)大于文獻(xiàn)[3]報(bào)道的1.0的平均值，可能是橄欖品質(zhì)較差，或摻入了低等級(jí)的初榨橄欖油。值得注意的是，5份標(biāo)稱產(chǎn)地為中國的特級(jí)初榨橄欖油，有4份樣品的脂肪酸乙酯含量遠(yuǎn)低于國際橄欖油協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)的限量，其中3份樣品的脂肪酸乙酯含量更是低于方法的檢出限。6份混合橄欖油中，有3份脂肪酸乙酯含量低于15 mg/kg，最低的僅為5.82 mg/kg，證明一定條件的高溫精煉可以降低橄欖油中的脂肪酸烷基酯含量，說明該指標(biāo)需與高溫精煉的標(biāo)記物豆甾二烯聯(lián)合檢測(cè)才能有效用于特級(jí)初榨橄欖油品質(zhì)鑒別與摻偽鑒別。

3 結(jié) 論

采用商品化硅膠固相萃取柱凈化，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)，建立了橄欖油中豆甾二烯含量的測(cè)定方法。該方法簡便快速，靈敏度、準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性均較好。結(jié)合橄欖油中脂肪酸烷基酯含量的測(cè)定，用于34批次標(biāo)稱不同等級(jí)的橄欖油與油橄欖果渣油樣品的分析。以國際橄欖油協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)COI/T.15/NC No 3/Rev. 14-2019作為判定依據(jù)，26份標(biāo)稱特級(jí)初榨橄欖油的樣品中有3份樣品豆甾二烯含量不符合要求；5份樣品脂肪酸乙酯含量不符合要求。分析表明：豆甾二烯可有效用于初榨橄欖油、混合橄欖油與混合油橄欖果渣油的鑒別，豆甾二烯與脂肪酸烷基酯聯(lián)合檢測(cè)可以用于特級(jí)初榨橄欖油品質(zhì)與摻偽的鑒別。