李秋雨，劉紅梅，李 彥，羅 燦，劉 焱

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)中心，湖南長沙 410128；3.芷江侗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南芷江 419100；4.長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長沙 410128）

0 引言

在傳統(tǒng)的生產(chǎn)加工過程中，膠原蛋白的來源物質(zhì)主要以陸生動(dòng)物的皮或者骨為主，但由于宗教信仰和動(dòng)物性流行?。ǒ偱２〉龋?的影響，膠原蛋白的原料來源在一定程度上受到了限制[1-3]。有研究表明，魚鱗主要是由蛋白質(zhì)、灰分構(gòu)成，而蛋白質(zhì)主要為膠原蛋白。因此，從魚鱗中回收利用膠原蛋白，可以彌補(bǔ)常規(guī)來源膠原蛋白的不足，增加淡水魚的附加值。魚鱗中灰分的主要成分為羥基磷灰石、磷酸鈣、磷酸鎂等物質(zhì)，其中羥基磷灰石含量最高，是灰分中的主要成分，其與膠原蛋白互相黏附，緊密結(jié)合，這種結(jié)構(gòu)會使膠原蛋白的提取難度增大[4-6]。因此，在提取膠原蛋白前必須將魚鱗的灰分除去。目前，灰分的去除方法主要有鹽酸法、檸檬酸法及EDTA 法[7-12]。但EDTA 價(jià)格昂貴，無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化脫灰，而鹽酸價(jià)格雖然便宜，卻會破壞魚鱗中的蛋白質(zhì)[13]。因此，選擇檸檬酸作為脫灰劑，以新鮮的草魚魚鱗為試驗(yàn)對象，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對草魚魚鱗脫灰工藝的最佳條件進(jìn)行研究，為后續(xù)進(jìn)一步研究魚鱗膠原蛋白作基礎(chǔ)[14-17]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮草魚魚鱗，收集于長沙馬王堆水產(chǎn)品市場；檸檬酸、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、95%乙醇、無水乙醚、石油醚、鹽酸、三乙醇胺、鈣指示劑、乙二胺四乙酸二鈉等，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司提供。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

SX-4-10 型馬弗爐，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；KDN-103F 型全自動(dòng)凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司產(chǎn)品；SXT-02 型索氏抽提器，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

篩選出新鮮完整、無破損的草魚魚鱗，用蒸餾水多次清洗，直至將魚鱗表面的細(xì)砂、土礫等雜質(zhì)去除干凈，將魚鱗表面的水分自然晾干，備用。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1） 不同檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對脫灰的影響。將預(yù)處理后的魚鱗樣品在4 ℃條件下，料液比為1∶16，檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度設(shè)置為2%，4%，6%，8%，10%，12%，浸泡6 h 對魚鱗中灰分的脫除率進(jìn)行測定，探究不同檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對魚鱗脫灰效果的影響。

（2） 不同料液比對脫灰的影響。將預(yù)處理后的魚鱗樣品在4 ℃條件下，檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，料液比設(shè)置為1∶10，1∶12，1∶14，1∶16，1∶18，1∶20，浸泡6 h，將魚鱗表面用蒸餾水清洗干凈，對魚鱗中灰分的脫除率進(jìn)行測定，探究不同料液比對魚鱗脫灰效果的影響。

（3） 不同浸泡時(shí)間對脫灰的影響。將預(yù)處理后的魚鱗樣品在4 ℃條件下，料液比為1∶16，檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，浸泡時(shí)間設(shè)置為2，4，6，8，10，12 h，將魚鱗表面用蒸餾水清洗干凈，對魚鱗中灰分的脫除率進(jìn)行測定，探究不同浸泡時(shí)間對魚鱗脫灰效果的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為探究檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、浸泡時(shí)間這3 個(gè)因素對魚鱗脫灰效果的影響，設(shè)計(jì)魚鱗脫灰工藝L9（34）的正交試驗(yàn)表。

1.2.4 草魚魚鱗基本成分的測定

（1） 水分含量的測定。參照GB 5009.3—2016 中的第一法進(jìn)行[18]。

（2） 灰分的測定。參照GB 5009.4—2016 中的第一法進(jìn)行[19]。

（3） 脂肪含量的測定。參照GB 5009.6—2016 中的索氏抽提法進(jìn)行[20]。

（4） 蛋白質(zhì)含量的測定。參照GB 5009.5—2016中的凱氏定氮法進(jìn)行[21]。

1.2.5 魚鱗中灰分脫除率的測定

草魚魚鱗中灰分脫除率的大小可以作為灰分脫除效果的判斷依據(jù)，灰分脫除率的計(jì)算公式如下：

式中：m1——新鮮草魚魚鱗中灰分的含量，mg；

m2——酸處理后樣品中灰分的殘留量，mg。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的表示方式，并用DPS 2018 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過LSD 法進(jìn)行組間顯著性檢驗(yàn)，顯著水平為p＜0.05；利用Origin 2018 軟件繪制試驗(yàn)結(jié)果圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚魚鱗脫灰工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對樣品脫灰效果的影響

檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與樣品灰分脫除率的關(guān)系見圖1。

圖1 檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與樣品灰分脫除率的關(guān)系

從圖1 可以看出，草魚魚鱗灰分的脫除率隨著檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高呈現(xiàn)先迅速升高后緩慢降低的趨勢，檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時(shí)，灰分的脫除率最高，為96.86%；檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于6%時(shí)，隨著檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的逐漸升高，魚鱗灰分的脫除率反而有所降低，這可能是因?yàn)楫?dāng)檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到反應(yīng)體系的最佳值時(shí)，再繼續(xù)增大檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)可能會使檸檬酸與鈣結(jié)合，結(jié)合的物質(zhì)附著在魚鱗的表面，阻止魚鱗中灰分的脫除，從而影響魚鱗中灰分的脫除效果。由此可以確定，該因素的3 個(gè)水平為4%，6%，8%。

2.1.2 料液比對樣品脫灰效果的影響

料液比與樣品灰分脫除率的關(guān)系見圖2。

從圖2 可以看出，魚鱗中灰分的脫除效果隨著料液比的增加而增大，當(dāng)料液比為1∶14 時(shí)，隨著料液比的增大，灰分的脫除率從94.73%增加到99.63%；而當(dāng)料液比大于1∶14 時(shí)，灰分的脫除率雖然在增加，但增加的幅度極小，幾乎可以忽略不計(jì)。由此可以確定，該因素的3 個(gè)水平為1∶12，1∶14，1∶16。

圖2 料液比與樣品灰分脫除率的關(guān)系

2.1.3 浸泡時(shí)間對脫灰效果的影響

浸泡時(shí)間與樣品灰分脫除率的關(guān)系見圖3。

圖3 浸泡時(shí)間與樣品灰分脫除率的關(guān)系

從圖3 可以看出，隨著浸泡時(shí)間的增長，魚鱗中灰分的脫除率呈現(xiàn)先大幅度增加后平穩(wěn)增加的趨勢。當(dāng)浸泡時(shí)間少于6 h 時(shí)，灰分的脫除率從94.08%增加到97.86%，增加了3.78%；當(dāng)浸泡時(shí)間多于6 h 時(shí)，魚鱗中灰分的脫除率從97.86%增加到98.09%，增加了0.23%，增加的幅度較小。由此可以確定，該因素的3 個(gè)水平為4，6，8 h。

2.2 草魚魚鱗脫灰工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、脫灰時(shí)間這3 個(gè)因素的3 個(gè)水平，為了明確各因素對脫灰效果影響的顯著性，采用LSD 法對正交試驗(yàn)的結(jié)果做方差分析。

樣品脫灰工藝正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，魚鱗脫灰工藝L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 樣品脫灰工藝正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

從表2 可以看出，草魚魚鱗中灰分的脫除率最高為99.63%，此時(shí)因素的組合為A1B2C2，影響魚鱗中灰分脫除效果的主次關(guān)系為因素B＞因素C＞因素A。從表3 可以看出，因素B 及因素C 對脫灰效果的影響顯著（p＜0.05），因素A 對脫灰效果的影響不顯著（p＞0.05）。分析試驗(yàn)結(jié)果可知，草魚魚鱗中灰分的脫除效果最佳的組合為A1B2C2，這與正交試驗(yàn)結(jié)果一致。因此，魚鱗脫灰的最佳工藝條件為A1B2C2，即以1∶14 的料液比和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的檸檬酸溶液處理魚鱗6 h 可使魚鱗中99.63%的灰分被脫去。

表2 魚鱗脫灰工藝L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.3 草魚魚鱗脫灰前后基本成分的變化

魚鱗脫灰前后基本成分的含量見表4。

表4 魚鱗脫灰前后基本成分的含量/%

從表4 可以看出，新鮮草魚鱗樣品中水分含量為12.66%，灰分含量為21.35%，總蛋白含量為56.6%，脂肪含量為0.235%，經(jīng)過脫灰處理后魚鱗樣品中水分含量為14.43%，總灰分含量為0.44%，總蛋白含量為83.04%，脂肪含量為0.076%。結(jié)果表明，未經(jīng)脫灰處理的魚鱗中灰分含量較高，會阻礙膠原蛋白的提取，而經(jīng)脫灰處理后魚鱗中的灰分含量低于2%，符合企業(yè)對灰分的要求。在脫灰的過程中脂肪含量降低到0.076%，這可能是因?yàn)轸~鱗中部分脂肪隨著檸檬酸溶液而流失。

3 結(jié)論

通過檸檬酸法研究草魚魚鱗脫灰的最優(yōu)工藝條件，結(jié)果顯示脫灰的最佳工藝條件為檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，料液比1∶14，浸泡時(shí)間6 h。在該工藝條件下，魚鱗中99.63%的灰分被脫去，魚鱗中剩余的灰分為0.37%，灰分含量符合企業(yè)生產(chǎn)加工的要求（低于2%）。有研究表明，魚鱗中脂肪與膠原蛋白緊密結(jié)合，其不利于膠原蛋白的提取。因此，為獲得目的膠原蛋白，在此之前還要對魚鱗樣品進(jìn)行脫脂處理。但魚鱗樣品經(jīng)過脫灰處理后，魚鱗中脂肪的含量從0.235%降低至0.076%，脂肪含量幾乎可以忽略不計(jì)。因此，經(jīng)該工藝處理的魚鱗，不僅可以最大程度地脫除灰分，還可以為后續(xù)的試驗(yàn)節(jié)省脫脂這一預(yù)處理的時(shí)間。