王丹陽，朱振元，代姝函，王萱萱，謝貝昱

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

杏鮑菇是一種食用大型真菌，因其具有杏仁的香味和菌肉肥厚如鮑魚的口感而得名，且集食用、藥用、食療于一體[1]。黃酮類化合物具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤等作用[2-3]。近些年對杏鮑菇黃酮的研究主要集中在提取方面，杏鮑菇黃酮類化合物的分離純化及活性方面的研究較少[4]。李士慧和王廣慧等人[5-6]對杏鮑菇黃酮提取工藝的優(yōu)化研究較深但在抗氧化活性方面卻涉及甚少。試驗對杏鮑菇黃酮進(jìn)行提取的優(yōu)化、精制及精制前后抗氧化活性的研究，意在杏鮑菇黃酮能夠更為廣泛地被應(yīng)用和開發(fā)，尤其在活性研究方面。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮杏鮑菇，市售；無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鄰二氮菲、鄰苯三酚、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、過硫酸鉀、抗壞血酸，均為分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海時代生物科技有限公司提供；AB-8 型大孔吸附樹脂300-400 目，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供；2,2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二銨鹽（ABTS），北京索萊寶科技有限公司提供；Tris 、1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼（DPPH），美國Sigma 公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

WN-500 型粉碎機(jī)，天津市康達(dá)電器有限公司產(chǎn)品；ESJ205-4 型電子天平，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司產(chǎn)品；HS3120 型超聲儀，天津市蘭博實驗儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；HW·SY 型電熱恒溫水浴鍋，北京市長風(fēng)儀器儀表公司產(chǎn)品；TGL-16B 型臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；SP-2102UV型紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；DHP-2000 型真空干燥箱，上海益恒科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃酮的提取

取50 g 杏鮑菇粉末，按照一定的料液比，加入乙醇溶液后，在一定的超聲時間和提取時間下進(jìn)行提取，得到杏鮑菇黃酮[8-9]。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸后得到固體杏鮑菇黃酮粗品。

1.3.2 總黃酮含量的測定

（1） 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[10]。精確稱取蘆丁標(biāo)品10.00 mg，用70%乙醇定容至100 mL，使其質(zhì)量濃度為100 μg/mL。用70%乙醇梯度稀釋成0，20，40，60，80，100 μg/mL。各取1.00 mL 于15 mL 帶塞試管中，分別加入70%乙醇1.00 mL，5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；再加10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉溶液2.00 mL，加蒸餾水至5 mL，搖勻，靜置15 min，以蘆丁0 μg/mL 作空白參比液，于波長510 nm 處測定吸光度，重復(fù)3 次，取平均值。

（2） 樣品總黃酮含量的測定。杏鮑菇黃酮類化合物含量的測定采用硝酸鋁顯色法[11]，精準(zhǔn)吸取1 mL待測樣品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測定樣品的吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，按下式計算杏鮑菇黃酮類化合物的含量（P）。

式中：P——杏鮑菇黃酮類化合物的含量，%；

C——黃酮類化合物的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——樣品溶液總體積，mL；

n——樣品溶液的稀釋倍數(shù)；

m——杏鮑菇粉末質(zhì)量，mg。

1.3.3 提取單因素試驗[12-13]

（1） 提取溫度對杏鮑菇黃酮提取率的影響。分別設(shè)置提取溫度為60，70，80，90 ℃共4 個平行試驗，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比1∶30，提取時間1 h，超聲時間15 min 的條件下提取杏鮑菇黃酮，并根據(jù)公式（1） 測得提取率。

（2） 乙醇體積分?jǐn)?shù)對杏鮑菇黃酮提取率的影響。分別設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，70%，80%，90%共4 個平行試驗，在提取溫度80 ℃，料液比1∶30，提取時間1 h，超聲15 min 的條件下提取杏鮑菇黃酮，并根據(jù)公式（1） 測得提取率。

（3） 料液比對杏鮑菇黃酮提取率的影響。分別設(shè)置料液比為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（g∶mL） 共4 個平行試驗，在提取溫度為80 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時間1 h，超聲時間15 min的條件下提取杏鮑菇黃酮，并根據(jù)公式（1） 測得提取率。

（4） 提取時間對杏鮑菇黃酮提取率的影響。分別設(shè)置提取時間為1.0，2.0，3.0，4.0 h 共4 個平行試驗，在提取溫度為80 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比1∶30，超聲時間15 min 的條件下提取杏鮑菇黃酮，并根據(jù)公式（1） 測得提取率。

（5） 超聲時間對杏鮑菇黃酮提取率的影響[14]。分別設(shè)置超聲時間為10，15，20，25 min 共4 個平行試驗，在提取溫度為80 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比1∶30，提取時間1 h 的條件下提取杏鮑菇黃酮，并根據(jù)公式（1） 測得提取率。

1.3.4 正交試驗設(shè)計[15-16]

以提取溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間為4 個因素，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗，進(jìn)一步優(yōu)化杏鮑菇黃酮的提取工藝。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

1.3.5 紫外分光光度計全波長掃描

利用紫外分光光度計全波長掃描法[17]對杏鮑菇提取物進(jìn)行全波長掃描，測定波長范圍為190～800 nm，掃描高度為-0.1～0.5 A，掃描速度為1 800 nm/min。

1.3.6 黃酮的顏色反應(yīng)

黃酮類化合物分子可與鋁鹽、鎂鹽等反應(yīng)生成絡(luò)合物[18]。在試管中加入現(xiàn)配的1%三氯化鋁溶液2 mL 和杏鮑菇提取液2 mL，靜置數(shù)分鐘觀察顏色變化。

1.3.7 AB-8 型大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附及靜態(tài)解析[19]

（1） 靜態(tài)吸附。稱取預(yù)處理的AB-8 型大孔吸附樹脂3 g，加入90 mL 樣液，封口。于溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min 的恒溫振蕩器上振蕩24 h，充分吸附后過濾，取濾液測定黃酮的質(zhì)量濃度，測定其吸附率。

式中：C0——樣液的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V0——樣液體積，mL；

C1——吸附后液體的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V1——吸附后液體體積，mL。

（2） 靜態(tài)解析。取上述的AB-8 型大孔吸附樹脂3 g，加入90 mL 樣液，封口。于溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min 的恒溫振蕩器上振蕩24 h，吸附達(dá)到完全飽和的狀態(tài)，過濾，用蒸餾水沖洗，直至濾液無色，加入70%乙醇90 mL，封口后，置于溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min 的恒溫振蕩器上振蕩24 h，使其完全解析后過濾，測得濾液的黃酮濃度，計算樹脂的解析率。

式中：C0——樣液的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V0——樣液體積，mL；

C1——吸附后液體的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V1——吸附后液體的體積，mL；

C2——解析后液體的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V2——解析后液體的質(zhì)量濃度。

1.3.8 杏鮑菇黃酮精制單因素試驗[20-22]

（1） 上樣濃度對杏鮑菇黃酮吸附率的影響。分別設(shè)置上樣質(zhì)量濃度為10，15，20，25 mg/mL 4 個平行試驗，在上樣量為0.7 BV 的條件下進(jìn)行吸附，待其完全吸附后，用蒸餾水洗柱直至流出的液體無色，測得流出液的黃酮含量，根據(jù)公式（2） 計算出杏鮑菇黃酮的吸附率。

（2） 上樣量對杏鮑菇黃酮吸附率的影響。分別設(shè)置上樣量為0.4，0.6，0.8，1.0 BV 4 個平行試驗，在上樣質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的條件下進(jìn)行吸附，待其完全吸附后，用蒸餾水洗柱直至流出的液體無色，測得流出液的黃酮含量，根據(jù)公式（2） 計算出杏鮑菇黃酮的吸附率。

（3） 洗脫質(zhì)量濃度對杏鮑菇黃酮解析率的影響。在上樣質(zhì)量濃度為10 mg/mL，上樣體積為0.7 BV 的吸附條件下，待其完全吸附后，用蒸餾水洗柱直至流出的液體無色并測得流出液的黃酮含量。分別設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，70%，80%，90%，洗脫量為3 BV 的條件下進(jìn)行洗脫，測的洗脫液的黃酮含量，根據(jù)公式（3） 計算出杏鮑菇黃酮的解析率。

（4） 洗脫量對杏鮑菇黃酮解析率的影響。在上樣質(zhì)量濃度為10 mg/mL，上樣體積為0.7 BV 的吸附條件下，待其完全吸附后，用蒸餾水洗柱直至流出的液體無色并測得流出液的黃酮含量。分別設(shè)置洗脫量為2.0，3.0，4.0，5.0 BV，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%的條件下進(jìn)行洗脫，測得洗脫液的黃酮含量，根據(jù)公式（3） 計算出杏鮑菇黃酮的解析率。

1.3.9 精制后黃酮含量測定

收集上述的乙醇洗脫液，經(jīng)旋蒸儀旋蒸，真空干燥后得到固體黃酮，用無水乙醇溶解后，制成樣品液，根據(jù)公式（1） 測定杏鮑菇粗黃酮純化后總黃酮含量。

1.3.10 體外抗氧化試驗[23-26]

（1） 對ABTS 自由基清除能力。取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL 的樣品液0.4 mL 與ABTS+溶液振蕩均勻，于室溫下反應(yīng)6 min，于波長734 nm 處測得吸光度Ax；相同條件下，用蒸餾水替代待測樣品作為對照管測得吸光度為Ao。每個樣品測定3 組平行，以抗壞血酸作陽性對照，按照下式計算清除率。

式中：Ao——空白組吸光度；

Ax——樣品組吸光度。

（2） 對DPPH 自由基的清除能力。取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL 的樣品液2 mL，加入0.2 mmol/L 的DPPH 溶液2 mL，在暗處反應(yīng)30 min，于波長517 nm 處測得吸光度A1；相同條件下，用無水乙醇代替DPPH 溶液測得吸光度為A2，用無水乙醇代替樣品液測得吸光度為A3。每個樣品測定3 組平行，以抗壞血酸作陽性對照，按照下式計算清除率。

式中：A1——2 mL 樣品液+ 2 mL DPPH 溶液；

A2——2 mL 樣品液+ 2 mL 無水乙醇；

A3——2 mL 無水乙醇+ 2 mL DPPH 溶液。

（3） 對超氧陰離子自由基的清除能力。將Tris-HCl 緩沖液放入25 ℃水浴鍋中保溫20 min，在樣品管中分別加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL的樣品液0.4 mL，加入4.5 mL Tris-HCl 緩沖液和0.1 mL 的7 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，混勻，25 ℃下反應(yīng)4 min，立即加入2 滴10 mol/L 鹽酸終止反應(yīng)，于波長325 nm 處測OD 值A(chǔ)x。相同條件下，用蒸餾水替代樣品和鄰苯三酚溶液作為空白管，用蒸餾水替代待測樣品作為對照管測得吸光度為Ao。每個樣品測定3 組平行，以抗壞血酸作陽性對照，按照下式計算清除率。

式中：A0——對照組吸光度；

Ax——樣本組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)得到如圖2 所示的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=0.003 2X-0.011 9，R2=0.994 5。

2.2 紫外分光光度計全波長掃描結(jié)果

紫外分光光度計全波長掃描結(jié)果見圖2。

圖2 紫外分光光度計全波長掃描結(jié)果

圖2 （a） 為杏鮑菇提取物的全波長掃描，圖2（b） 為純化后杏鮑菇黃酮的全波長掃描。兩張圖都在200～300 nm 處出現(xiàn)吸收峰，在300～800 nm 處無明顯吸收峰。大部分黃酮類化合物在200～300 nm 處有明顯的吸收峰，可以初步確定杏鮑菇提取物中含有黃酮。

2.3 黃酮顏色反應(yīng)結(jié)果

樣品溶液與1%三氯化鋁溶液反應(yīng)后，溶液顏色變?yōu)辄S色，并生成黃色絡(luò)合物，符合黃酮類化合物呈色反應(yīng)結(jié)果，表明杏鮑菇提取物中含有黃酮類化合物。

2.4 提取單因素試驗分析結(jié)果

單因素試驗結(jié)果見圖3。

圖3 單因素試驗結(jié)果

由圖3（a） 可知，隨著提取溫度的增加，杏鮑菇黃酮的提取率呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢，當(dāng)提取溫度為80 ℃時黃酮的提取率最高，為2.35%。因此，提取杏鮑菇黃酮時提取溫度選用80℃為宜。由圖3（b） 可知，黃酮的提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先增大再下降，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時達(dá)到最高，為2.36%。因此，提取黃酮時選用80%乙醇溶液為宜。由圖3（c） 可知，黃酮的提取率隨料液比的增大先上升后下降，在料液比為1∶30 時的提取率最高，為2.46%，因此提取黃酮時料液比選用1∶30為宜。由圖3（d） 可知，黃酮提取率隨提取時間的加長先上升再下降，在提取時間為2 h 時達(dá)到最高，為2.62%。因此，提取黃酮時提取時間選用2 h 為宜。由圖3（e） 可知，超聲時間對黃酮的提取率影響程度較小，故正交試驗不包含此因素。

2.5 提取正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比、提取溫度對黃酮提取率的影響較大，因此以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比、提取溫度為4 個因素，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗進(jìn)一步優(yōu)化杏鮑菇黃酮提取的工藝條件。

正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

由表2 可知，4 個因素對杏鮑菇黃酮提取率的影響順序為A＞C＞B＞D，乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響最大，提取溫度次之，提取時間和料液比對黃酮提取率的影響較小且影響力相當(dāng)。杏鮑菇提取的最佳條件為A2B2C3D3，對此條件進(jìn)行驗證試驗，提取率為2.83%，高于正交試驗中的組合，因此確定杏鮑菇醇提的最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取溫度85 ℃，提取時間2 h，料液比1∶40。

2.6 AB-8 型大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附及靜態(tài)解析結(jié)果

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)及1.3.7（1） 中的公式，計算出AB-8 型對杏鮑菇黃酮的靜態(tài)吸附率為70.42%。

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)及1.3.7（2） 中的公式，計算出AB-8 型對杏鮑菇黃酮的靜態(tài)解析率為50.26%。

2.7 杏鮑菇黃酮精制單因素試驗分析結(jié)果

杏鮑菇黃酮精制單因素試驗結(jié)果見圖4。

圖4 杏鮑菇黃酮精制單因素試驗結(jié)果

由圖4（a） 可知，隨著上樣質(zhì)量濃度的增加，AB-8 型大孔吸附樹脂對杏鮑菇黃酮的吸附率先增加后減少。在上樣質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時，吸附率達(dá)到最大，為79.87%。由圖4（b） 可知，AB-8 型大孔吸附樹脂對杏鮑菇黃酮的吸附率隨上樣量的加大先上升后下降，在上樣量為0.8 BV 時吸附率達(dá)到最大，為77.16%。由圖4（c） 可知，隨著洗脫濃度的增大，解析率不斷上升且在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時解析率達(dá)到最大，最大為75.71%，在乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80%時，解析率緩慢下降。由圖4（d） 可知，隨著洗脫量的加大，解析率不斷增加且增加的速度逐漸減緩，洗脫量為5 BV 時解析率最大，為74.48%。故初步認(rèn)定在采用AB-8 型大孔吸附樹脂精制黃酮時在上樣量為20 mg/mL，上樣量為0.8 BV，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，洗脫量為5 BV 的條件下效果較好。對此條件進(jìn)行驗證試驗，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)及1.3.2（2） 中的公式，計算出粗黃酮精制后黃酮含量為36.07%。高于單因素試驗的任意一組，故在精制工藝條件采用上樣質(zhì)量濃度20 mg/mL，上樣量0.8 BV，洗脫體積分?jǐn)?shù)80%，洗脫量5 BV 為宜。

2.8 杏鮑菇黃酮精制前后體外抗氧化結(jié)果分析

ABTS 自由基清除率見表3。

表3 ABTS 自由基清除率

由表3 可知，隨著杏鮑菇黃酮質(zhì)量濃度的升高，精制前后的杏鮑菇黃酮對ABTS 自由基的清除率升高。當(dāng)杏鮑菇黃酮質(zhì)量濃度為3 mg/mL 時，杏鮑菇粗黃酮對ABTS 自由基的清除率達(dá)到92.21%，精制后的杏鮑菇黃酮對ABTS 自由基的清除率達(dá)到96.82%。結(jié)果表明，精制前后的杏鮑菇黃酮對ABTS自由基均具有強(qiáng)清除能力。

DPPH 自由基清除率見表4。

表4 DPPH 自由基清除率

由表4 可知，隨著杏鮑菇黃酮質(zhì)量濃度的升高，精制前后的杏鮑菇黃酮對DPPH 自由基的清除率不斷提高，當(dāng)杏鮑菇黃酮質(zhì)量濃度為3 mg/mL 時，杏鮑菇粗黃酮對DPPH 自由基的清除率達(dá)到37.23%，精制后的杏鮑菇黃酮對DPPH 自由基的清除率達(dá)到95.12%。結(jié)果表明，精制后的杏鮑菇黃酮對DPPH自由基具有強(qiáng)清除能力。

超氧陰離子自由基清除率見表5。

表5 超氧陰離子自由基清除率

由表5 可知，杏鮑菇粗黃酮對超氧陰離子自由基的清除率為6.23%，表明杏鮑菇粗黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力較弱。且試驗數(shù)據(jù)A0=0.353，Ax1=0.349， Ax2=0.351， Ax3=0.467， Ax4=0.399， Ax5=0.493，Ax6=0.424（X1～X6代表精制后杏鮑菇黃酮的質(zhì)量濃度0.5～3.0 mg/mL）。Ax值始終比A0的值大，也就說明杏鮑菇黃酮對超氧陰離子自由基無清除作用。孟鵬舉等人[27]在滑子菇黃酮醇提工藝及抗氧化活性研究的試驗中發(fā)現(xiàn)，滑子菇黃酮對超氧陰離子自由基并無清除作用。

3 結(jié)論

對杏鮑菇黃酮的提取條件進(jìn)行單因素試驗和正交試驗分析，得到最優(yōu)的提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取溫度為85 ℃，提取時間為2 h，料液比為1∶40（g∶mL），此條件下杏鮑菇黃酮的提取率最大，為2.83%。并通過紫外分光光度法對杏鮑菇提取物進(jìn)行全波長掃描，初步確定杏鮑菇提取物中含有黃酮，再經(jīng)顏色反應(yīng)鑒定，驗證了黃酮的存在。其次，試驗用AB-8 型大孔吸附樹脂對杏鮑菇黃酮進(jìn)行精制單因素試驗，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度20 mg/mL，上樣量0.8 BV，洗脫體積分?jǐn)?shù)80%，洗脫量5 BV 時，效果最好，精制后黃酮含量為36.07%。在抗氧化活性試驗中，當(dāng)精制后杏鮑菇黃酮的質(zhì)量濃度為3 mg/mL 時，對ABTS 自由基的清除率達(dá)到96.82%，對DPPH 自由基的清除率達(dá)到95.12%，對超氧陰離子自由基無清除作用。綜上所述，杏鮑菇黃酮有一定的抗氧化能力，但均弱于抗壞血酸。