韓 輝 傅曉丹 俞健益 黃 佼 張險峰

Graves病(Graves′ disease，GD)是一種發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚的自身免疫性疾病，主要發(fā)生在甲狀腺，但其臨床表現(xiàn)不局限于甲狀腺一個器官，還伴有多系統(tǒng)綜合征，包括高代謝綜合征、彌漫性甲狀腺腫、眼部癥狀和皮膚病變等[1]。目前對GD病因的認(rèn)識主要分為3個方面。遺傳影響已被認(rèn)為與GD的發(fā)病密切相關(guān)，多有家族史，且多發(fā)生于女性，約15%的患者發(fā)病與遺傳因素有關(guān)[2]。精神創(chuàng)傷也被認(rèn)為是GD的發(fā)病因素，由于各種原因引起的過度興奮或過度抑郁可導(dǎo)致甲狀腺激素的過度分泌，這可能是由于在高應(yīng)激狀態(tài)下腎上腺皮質(zhì)激素的分泌急劇增加，從而改變了抑制性T淋巴細(xì)胞(Ts)或輔助性T細(xì)胞(Th)的活性有關(guān)[3]。免疫系統(tǒng)的異常也被認(rèn)為是其中一個因素[4]，由于缺乏特異性的自身抗原耐受，甲狀腺刺激素受體(TSHR)在GD的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的中介作用。

作為最常用的腫瘤免疫治療方法，程序化死亡受體1(PD-1)抑制劑的應(yīng)用能夠激活T淋巴細(xì)胞，從而進(jìn)一步促進(jìn)人體免疫系統(tǒng)對惡性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[5，6]。PD-1是重要的免疫抑制分子，屬于CD28超家族成員，最初來源于凋亡的小鼠T細(xì)胞雜交瘤[7]。以PD-1為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)在抗腫瘤、抗感染、抗炎、抗自身免疫性疾病、提高器官移植成活率等方面具有重要意義[8～10]。

本研究通過檢測GD患者外周血中PD-1的表達(dá)水平，探討其對淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系中甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增殖及炎性因子的影響。

對象與方法

1.實(shí)驗(yàn)對象:取2017年5月～2018年6月在杭州市第一人民醫(yī)院就診的12例Graves病患者外周血，12例健康體檢者采集等量外周血。樣本采集前，患者和健康體檢者徹夜禁食。將標(biāo)本分成3部分，一部分保存在含有乙二胺四乙酸抗凝劑的試管中，用于采集外周血單個核細(xì)胞，另一部分用2500×g離心15min獲得血清，最后一部分直接作為外周血保存，全部保存在4℃冰箱中。所有受試者均簽署了知情同意書。該臨床試驗(yàn)計劃已通過杭州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會的審查和批準(zhǔn)。正常人甲狀腺細(xì)胞系Nthy-Ori3-1(BNCC340487)購自北京北納生物有限公司，在37℃含10%胎牛血清(10099141，美國Gibco公司)的90%RPMI1640(670089，美國Gibco公司)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Graves病診斷標(biāo)準(zhǔn)：①臨床甲亢癥狀和體征；②甲狀腺彌漫性腫大(觸診和B超證實(shí))，少數(shù)病例可以無甲狀腺腫大；③血清TSH濃度降低，甲狀腺激素濃度升高；④眼球突出和其他浸潤性眼征；⑤脛前黏液性水腫；⑥甲狀腺TSH受體抗體(TRAb或TSAb)陽性；以上標(biāo)準(zhǔn)中①～③項(xiàng)為診斷必備條件，④～⑥項(xiàng)為診斷輔助條件。

2.ELISA法:ELISA法檢測血清和細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子水平。干擾素-γ(PI511)、IL-4(PI618)、IL-17(PI550)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(PT880)ELISA試劑盒均購自中國碧藍(lán)天生物公司。所有操作均按照制造商的說明書進(jìn)行。

3.PBMC的分離：外周血用0.9%鈣(Ca+)和鎂(Mg+)離子PBS緩沖液(德國BioChrome AG公司)均勻稀釋，然后覆蓋在3ml Gradisol L制劑(波蘭Aqua Medica公司)上，然后在700×g下用密度梯度離心20min。用無菌移液管采集PBMCs，用無鈣、無鎂的PBS緩沖液沖洗。然后將細(xì)胞懸浮在1ml如上所述的相同的PBS緩沖液中，4℃保存。

4.流式細(xì)胞儀檢測:將獲得的外周血單個核細(xì)胞懸液以1×106的體積分布于試管中，在單克隆抗體(20μl)和熒光素的共同作用下室溫培養(yǎng)20min。檢測T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+細(xì)胞PD-1狀態(tài)的抗體清單及其同型對照購自美國BD Biosciences公司，如表1所示。然后，細(xì)胞在700×g下沖洗離心5min，用美國Becton Dickinson公司的FACS Calibur流式細(xì)胞儀(每次30000個細(xì)胞)分析，F(xiàn)ACS Diva軟件6.13(BD)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，CellQuest Pro軟件(美國Becton Dickinson公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。流式細(xì)胞儀分析的最終數(shù)據(jù)為一系列單克隆抗體染色的細(xì)胞，結(jié)合熒光染色，以平均熒光強(qiáng)度(MFI)表示細(xì)胞膜上抗原表達(dá)的增強(qiáng)。

表1 檢測CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1的抗體

5.CCK-8法:CCK-8法檢測Nthy-Ori3-1細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后的存活率。將體積為5×103個細(xì)胞的Nthy-Ori3-1細(xì)胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中。在12、24和48h后，應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)試劑盒(中國Beyotime公司)按照制造商的建議檢測細(xì)胞活力，并使用El×800讀取器(美國Bio-Tek Instruments Inc公司)在450nm下進(jìn)行測量。

結(jié) 果

1．GD患者炎性細(xì)胞因子水平:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)顯示，與健康對照組比較，GD患者血清中所有炎性相關(guān)細(xì)胞因子(干擾素-γ、IL-4、IL-17和轉(zhuǎn)化生長因子-β)水平均顯著升高(P<0.05，圖1)。

圖1 GD患者血清IFN-γ(A)、IL-4(B)、IL-17(C)、TGF-β(D)水平與對照組比較，*P<0.05

2.GD患者外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞水平及PD-1的表達(dá)水平：檢測GD患者和健康人PBMC中CD4+、CD8+T細(xì)胞的百分率，與健康人比較，GD患者CD4+T細(xì)胞數(shù)量增加，CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少，CD4+/CD8+比值升高(圖2A～C)。同時，流式細(xì)胞儀還檢測到GD患者CD4+和CD8+T細(xì)胞中PD-1水平，兩種細(xì)胞中PD-1水平均顯著升高(圖2D～G)。

圖2 GD患者外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞水平及PD-1的表達(dá)水平A、B.PBMCs中CD4+、CD8+T細(xì)胞百分率；C.CD4+/CD8+比值；D～G.外周血CD4+PD-1+、CD8+PD-1+細(xì)胞膜上PD-1的水平；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

3.PD-1+T淋巴細(xì)胞促進(jìn)共培養(yǎng)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增殖：選擇CD4+PD-1+/-、CD8+PD-1+T淋巴細(xì)胞與甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測其細(xì)胞活力及炎性相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，觀察其對甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。與CD4+PD-1+/-、CD8+PD-1+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用。在CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞上均存在PD-1可顯著提高細(xì)胞活性，當(dāng)CD4+或CD8+細(xì)胞上存在PD-1時，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的活性仍顯著高于不存在PD-1的情況(圖3)。

圖3 PD-1+T淋巴細(xì)胞促進(jìn)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增殖A.CCK-8法檢測細(xì)胞活性；B.凋亡率；與CD4+PD-1++CD8+PD-1+組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000;與CD4+PD-1-+CD8+PD-1-組比較，#P<0.05，##P<0.01

4.PD-1+T淋巴細(xì)胞對共培養(yǎng)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響：與CD4+PD-1+/-+CD8+PD-1+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞與CD4+PD-1+/-、CD8+PD-1+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后的IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β的表達(dá)水平最高。當(dāng)兩者都不存在PD-1時，共培養(yǎng)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞中IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β的表達(dá)水平最低(圖4)。

討 論

GD是一種自身免疫性甲狀腺疾病，造成GD的因素較多，目前公認(rèn)的包括遺傳、飲食、精神、感染與炎癥等[11]。但無論這些因素如何，其直接機(jī)制均在于體內(nèi)具有不同功能的免疫細(xì)胞之間比例失衡進(jìn)而導(dǎo)致的免疫功能異常。本研究檢測到的GD患者干擾素-γ、IL-4、IL-17和轉(zhuǎn)化生長因子-β水平的升高，也再次驗(yàn)證了GD與炎性反應(yīng)之間的對應(yīng)關(guān)系[12，13]。據(jù)相關(guān)報道，在非肥胖小鼠中，活化的T細(xì)胞可能會分泌更多的促炎細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致糖尿病的快速進(jìn)展[14]。

程序性死亡分子1(programmed death-1，PD-1)是一種負(fù)性共刺激分子，在很多疾病的發(fā)展過程中都發(fā)揮著重大作用。PD-1可以在人類的T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞和自然殺傷T細(xì)胞上表達(dá)。在胸腺、骨髓、脾等淋巴組織可低水平表達(dá)，通常PD-1只在活化的T細(xì)胞中表達(dá)。PD-1抑制劑是近年來在抗腫瘤領(lǐng)域最大的突破，PD-1抑制劑在具有抗腫瘤作用的同時，也介導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生了抗甲狀腺作用，與免疫性不良事件存在相關(guān)性[15]。進(jìn)一步表明了PD-1/PD-L1相關(guān)的免疫機(jī)制在甲狀腺功能中的重要性。PD-1作為調(diào)控淋巴細(xì)胞功能以及多種淋巴細(xì)胞間穩(wěn)態(tài)平衡的分子機(jī)制，本研究在細(xì)胞分選的基礎(chǔ)上，對甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，對照觀察不同比例的CD4+PD-1+細(xì)胞和CD8+PD-1+細(xì)胞對甲狀腺細(xì)胞增殖、凋亡水平的影響，進(jìn)一步挖掘PD-1對甲狀腺細(xì)胞的作用與影響機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，GD患者CD4+T細(xì)胞百分率升高，CD8+T細(xì)胞水平降低，兩種T細(xì)胞上PD-1表達(dá)均呈上調(diào)趨勢。由于PD-1屬于CD28家族中起重要的抑制作用并維持淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一類分子，因此如若PD-1表達(dá)發(fā)生變化，則可能影響各類淋巴細(xì)胞間的平衡，甚至整個免疫系統(tǒng)的功能。研究表明，正常情況下，當(dāng)T細(xì)胞受體結(jié)合率較高時，PD-1才發(fā)揮削弱T細(xì)胞應(yīng)答的作用[16]。若PD-1/PD-L1通路被過度激活，淋巴細(xì)胞正常的免疫殺傷功能受到抑制，這就是腫瘤細(xì)胞通過“免疫逃逸”進(jìn)而惡性增殖的關(guān)鍵機(jī)制。PD-1的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)，與B細(xì)胞淋巴瘤一樣，高水平的PD-1被認(rèn)為通過影響腫瘤的微環(huán)境與淋巴瘤的復(fù)發(fā)有關(guān)，PD-1/PD-L1通路的阻斷在某些方面加重了內(nèi)源性抗腫瘤反應(yīng)[17，18]。

在隨后的研究中，CD4+PD-1+和CD8+PD-1+T細(xì)胞與甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，揭示了PD-1表達(dá)與甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞之間的潛在關(guān)系。與PD-1+CD4+/CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞，細(xì)胞存活率高，炎性因子表達(dá)水平高，提示淋巴細(xì)胞中PD-1的存在可能促進(jìn)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的生長、分化和炎性細(xì)胞因子的分泌水平，可能造成GD的發(fā)生和發(fā)展。PD-1和PD-1/PD-L1通路在自身免疫性疾病中的作用已被廣泛認(rèn)識[7]。

目前認(rèn)為GD在免疫功能失調(diào)方面的直接機(jī)制在于體內(nèi)不同功能免疫細(xì)胞的失衡。在GD中，PD-1的高表達(dá)不僅在本研究中被觀察到，也被其他研究所證實(shí)，研究認(rèn)為PD-1/PD-L1通路在AITD腺體中被激活，但可能沒有達(dá)到抑制疾病進(jìn)展的程度[19]。此外，外周血中T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的異常分布在GD患者自身免疫的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了淋巴細(xì)胞膜上PD-1在影響甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增殖及炎性細(xì)胞因子的變化中的作用。GD患者PD-1高表達(dá)，CD4+T細(xì)胞水平升高，CD8+T細(xì)胞水平降低。此外，淋巴細(xì)胞中PD-1的存在可能通過促進(jìn)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞活性，炎性細(xì)胞因子水平升高，可能進(jìn)一步加速GD的發(fā)生和發(fā)展。