吳 愷，何宏博，張 澎，曾 誠，劉東雷，趙 松

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

食管癌作為中國(guó)最常見的、最具侵襲性的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有發(fā)病率、致死率高、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。據(jù)世界癌癥報(bào)告統(tǒng)計(jì)，食管鱗狀細(xì)胞癌為食管癌的主要病理類型[2]。此外，食管癌的耐藥、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等均嚴(yán)重限制了患者的化療成功率。目前，以順鉑為基礎(chǔ)的化療仍是食管鱗癌患者最為常見的化療方案，但部分食管癌患者連續(xù)治療一段時(shí)間后對(duì)順鉑的敏感性較差，導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生，引起食管癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的治療[3-4]。因此，了解食管鱗癌的耐藥機(jī)制，篩選與耐藥相關(guān)的新靶點(diǎn)，可顯著提高臨床精準(zhǔn)治療，提高患者的合理用藥，改善預(yù)后。

微小RNAs(micro RNAs, miR)是一種存在于生物體內(nèi)的、高度保守的、長(zhǎng)度約為21～25 nt的非編碼內(nèi)源性單鏈小RNA，其可通過與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)域結(jié)合降解/抑制靶基因mRNA的表達(dá)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及對(duì)藥物的敏感性[5-6]。據(jù)研究[7]報(bào)道，骨肉瘤中miR-454的表達(dá)顯著降低，且過表達(dá)miR-454可抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)和侵襲。而miR-454高表達(dá)的肝癌患者具有更短的生存期和更差的預(yù)后[8]。此外，miR-454在肺癌和結(jié)腸癌中可作為一種促癌基因，下調(diào)miR-454可降低降低癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)其凋亡[9-10]。這些研究結(jié)果均提示miR-454在不同腫瘤中的功能具有多樣性。但目前有關(guān)miR-454在食管鱗癌化療敏感性中的功能及調(diào)控機(jī)制仍無報(bào)道?；诖耍U明miR-454在順鉑耐藥的食管鱗癌中的生物特性、對(duì)順鉑化療敏感性的影響及分子機(jī)制，可為其作為靶點(diǎn)應(yīng)用于食管鱗癌的綜合治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑食管鱗癌細(xì)胞EC109購自上海生物科學(xué)院細(xì)胞庫；順鉑、二甲基亞砜、噻唑藍(lán)(MTT)購自美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640、胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司；TRIzol試劑及RNA提取試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；miRNeasy?Mini Kit購自德國(guó)Qiagen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)試劑盒均購自美國(guó)Thermo公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen 公司；過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)γ、AKT、鼠抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體購自美國(guó)Abcam公司；鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；miR-454模擬物及其相應(yīng)的陰性對(duì)照mimic miR-454 control均購自上海生工生物工程有限公司；miR-454 inhibitor、內(nèi)參基因U6購自上海吉瑪有限公司。本實(shí)驗(yàn)中涉及的基因及引物序列見表1。

1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng)采用體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)EC109細(xì)胞，在37 ℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建及培養(yǎng)采用遞增藥物濃度-間歇沖擊作用的方法構(gòu)建順鉑食管鱗癌耐藥細(xì)胞株EC109/DPP。取狀態(tài)良好并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109細(xì)胞，最開始加入順鉑(1 μmol/L)開始培養(yǎng)，24 h后更換全新的新鮮RPMI-1640完全培養(yǎng)基，待EC109細(xì)胞再次正常生長(zhǎng)后再次加入順鉑(1 μmol/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)EC109細(xì)胞。直到EC109細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)且傳代3次以上，測(cè)定IC50。在培養(yǎng)基中反復(fù)加入逐漸遞增濃度的順鉑一直到EC109細(xì)胞能在Cisplatin(10 μmol/L)的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)且傳代代3 次以上，測(cè)定IC50。

1.4 miRNA轉(zhuǎn)染選取處于對(duì)數(shù)期且生長(zhǎng)良好的EC109/DPP細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將EC109/DPP細(xì)胞進(jìn)行6孔板鋪板，鋪板的密度為3×105個(gè)細(xì)胞/孔，鋪板后進(jìn)行培養(yǎng)，過夜。按照Lipofectamine 2000的說明書，首先調(diào)整脂質(zhì)體與miR的比例，選取細(xì)胞生長(zhǎng)最好的最佳比例，進(jìn)行miR轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，將EC109/DPP細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱中，每4～6 h的培養(yǎng)期間更換新鮮的含血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基因序列見表1。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)miR-454表達(dá)采用miRNeasy?Mini Kit提取試劑盒提取EC109/DPP細(xì)胞的miRNA。分別檢測(cè)各組細(xì)胞中RNA濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄RNA，采用U6作為內(nèi)參(內(nèi)參引物見表1)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)選用miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒，平行實(shí)驗(yàn)每組均重復(fù)3次，計(jì)算平均Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt相對(duì)定量計(jì)算公式計(jì)算miR-454在各組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 基因及引物序列

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖采用MTT法檢測(cè)各種細(xì)胞的增殖情況。將各組細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)置接種的密度約為1×104個(gè)細(xì)胞/孔(96孔板，每孔100 μL)，將各組細(xì)胞接種后置于恒溫箱連續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后將培養(yǎng)基更換為含順鉑培養(yǎng)基，設(shè)置順鉑的梯度濃度，使其分別為2、4、8、16、32 μmol/L。同時(shí)，根據(jù)相同的條件培養(yǎng)空白組、陰性對(duì)照組細(xì)胞(僅含培養(yǎng)基)。將各組細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h后進(jìn)行收集，再加入MTT避光培養(yǎng)，4 h后棄掉培養(yǎng)基加入二甲基亞砜，振蕩、靜置一定時(shí)間后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(波長(zhǎng)為570 nm)。根據(jù)每組細(xì)胞的吸光度計(jì)算存活率(各組重復(fù)3次)。

1.7 Western blot法檢測(cè)PPARγ、AKT蛋白表達(dá)水平消化收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度。以體積分?jǐn)?shù)10%分離膠的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠凝膠法跑電泳，蛋白轉(zhuǎn)至聚二偏氟乙烯膜，體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清封閉2 h后孵育一抗(1600)、β-actin(13 000)，4 ℃孵育過夜。搖床室溫孵育二抗2 h。將聚二偏氟乙烯膜洗滌3次，每次20 min，加入ECL顯色劑。采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，分析各組條帶的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 EC109、EC109/DPP細(xì)胞耐藥性比較與EC109細(xì)胞比較，EC109/DPP細(xì)胞在經(jīng)過不同濃度順鉑處理后，細(xì)胞增殖顯著受抑制；EC109、EC109/DPP細(xì)胞的IC50值分別為(3.53±0.23)μmol/L和(23.61±1.48)μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.179，P<0.001)。結(jié)果表明，EC109/DPP細(xì)胞耐藥株構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 順鉑對(duì)EC109、EC109/DPP細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)比較

2.2 EC109、EC109/DPP細(xì)胞中miR-454表達(dá)水平比較利用qRT-PCR檢測(cè)EC109、EC109/DPP細(xì)胞中miR-454表達(dá)。EC109/DPP細(xì)胞中miR-454的相對(duì)表達(dá)量顯著高于EC109細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量(t=18.931，P<0.001)。此外,與空白組比較，轉(zhuǎn)染miR-454抑制劑下調(diào)miR-454后EC109/DPP細(xì)胞miR-454相對(duì)表達(dá)量明顯降低(t=3.986，P=0.016)。結(jié)果表明miR-454抑制劑可抑制miR-454表達(dá)。見圖2。

2.3 下調(diào)miR-454增加EC109/DPP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性隨加入順鉑濃度的增加，與EC109/DPP細(xì)胞比較，順鉑+下調(diào)miR-454組顯著增加了EC109/DPP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。IC50值分別為(21.01±1.91)μmol/L和(12.43±2.40)μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.843，P=0.008)。這提示隨加入順鉑濃度的增加，與EC109/DPP細(xì)胞比較，順鉑+下調(diào)miR-454組顯著增加了EC109/DPP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。見圖3。

2.4 下調(diào)miR-454對(duì)PPAR-γ和AKT蛋白表達(dá)的影響采用Western Blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后的EC109/DPP細(xì)胞中PPAR-γ和AKT蛋白表達(dá)。下調(diào)miR-454組的EC109/DPP細(xì)胞可顯著上調(diào)PPAR-γ，下調(diào)AKT蛋白(P均<0.05)。結(jié)果提示下調(diào)miR-454增加EC109/DPP細(xì)胞順鉑敏感性的機(jī)制可能與調(diào)控PPAR-γ和AKT蛋白有關(guān)。見圖4。

圖2 EC109、EC109/DPP細(xì)胞中miR-454表達(dá)水平比較

A：EC109、EC109/DPP細(xì)胞中miR-454表達(dá)；B：EC109/DPP細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)染miR-454抑制劑后miR-454表達(dá)。與EC109細(xì)胞比較，1)P<0.05；與空白組比較；2)P<0.05

圖3 下調(diào)miR-454對(duì)EC109/DPP細(xì)胞順鉑敏感性的影響

3 討論

食管鱗癌是最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，為河南省較為特異性高發(fā)的腫瘤。許多患者確診時(shí)已為中期或晚期，進(jìn)展較快，預(yù)后極差，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[2]。以順鉑為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)化療方案目前仍為食管癌治療的常規(guī)治療方案，在食管癌患者中廣泛應(yīng)用。但許多患者在應(yīng)用此化療方案一段時(shí)間后對(duì)順鉑產(chǎn)生了耐藥，化療過程中產(chǎn)生的耐藥、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)進(jìn)一步造成食管鱗癌患者的化療失敗和死亡[3]。食管癌的耐藥機(jī)制是一個(gè)多因素、多機(jī)制參與的復(fù)雜過程，主要與多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)生物活性酶活性的改變、p53及微管蛋白改變、熱休克蛋白改變等密切相關(guān)[4]。但食管鱗癌耐藥的機(jī)制仍未完全闡釋清楚。

近年來，許多研究報(bào)道m(xù)iR可與相應(yīng)靶基因mRNA的非編碼區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移[5]。miR在許多惡性腫瘤中異常表達(dá)，作為癌基因或抑癌基因在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及耐藥過程中發(fā)揮著重要的作用。關(guān)于miR-454調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)相關(guān)研究受到廣泛關(guān)注。miR-454在不同腫瘤中發(fā)揮著不同的作用。如過表達(dá)miR-454可抑制骨肉瘤、肝癌等的生長(zhǎng)和侵襲；下調(diào)miR-454可降低腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)其凋亡。但目前仍未有miR-454在食管鱗癌化療敏感性中的作用及機(jī)制等相關(guān)報(bào)道。

本課題組前期基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-454在順鉑耐藥的EC109細(xì)胞中特異性高表達(dá)。結(jié)果表明miR-454可能參與EC109/DPP細(xì)胞的調(diào)控。黃云龍等[11]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-218有助于增加食管鱗癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，給對(duì)順鉑耐藥的食管鱗癌患者提供潛在的基因治療靶點(diǎn)；而馬鳴等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-429可通過抑制Bmi-1表達(dá)提高食管鱗癌細(xì)胞的化療敏感性。以上結(jié)果說明miR可調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞的化療敏感性。因此，本研究擬進(jìn)一步探究miR-454在EC109/DPP細(xì)胞中的作用及相關(guān)機(jī)制。

圖4 miR-454對(duì)EC109/DPP細(xì)胞中PPAR-γ和AKT蛋白表達(dá)的影響

本研究采用遞增藥物濃度-間歇沖擊結(jié)合的方法誘導(dǎo)EC109/DPP細(xì)胞，此方法已被廣泛應(yīng)用[13-14]，本研究在以上研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)了方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與EC109細(xì)胞比較，EC109/DPP細(xì)胞在經(jīng)過不同濃度順鉑處理后，細(xì)胞增殖顯著受到抑制；EC109細(xì)胞、EC109/DPP細(xì)胞的IC50值分別為(3.49±1.05)μmol/L和(23.18±1.22)μmol/L。結(jié)果表明，EC109/DPP細(xì)胞耐藥株構(gòu)建成功。

qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，與EC109細(xì)胞比較，EC109/DPP細(xì)胞中miR-454的相對(duì)表達(dá)量顯著升高。EC109/DPP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-454抑制劑后可顯著下調(diào)miR-454的表達(dá)。而miR-454可能在EC109/DPP細(xì)胞中發(fā)揮一定的作用。本文結(jié)果顯示，隨加入順鉑濃度的增加，與EC109/DPP細(xì)胞比較，下調(diào)miR-454顯著增加了EC109/DPP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。上述結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-454可調(diào)控EC109細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。

PPAR-γ作為PPARs家族的一種核轉(zhuǎn)錄因子，與相應(yīng)配體結(jié)合后可誘導(dǎo)或抑制靶基因的表達(dá)[15]。據(jù)研究[16]報(bào)道，PPAR-γ表達(dá)于肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中。高表達(dá)PPAR-γ的乳腺癌患者疾病無進(jìn)展生存期更長(zhǎng)[17]。而在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，PPAR-γ活化可致腫瘤細(xì)胞分化并誘導(dǎo)其凋亡[18]。但PPAR-γ在食管癌耐藥中的作用報(bào)道極少。根據(jù)上述結(jié)果我們可推測(cè)，PPAR-γ下調(diào)可能為腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制之一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組和順鉑組比較，下調(diào)miR-454組和順鉑+下調(diào)miR-454組的EC109/DPP細(xì)胞可顯著上調(diào)PPAR-γ。此外，EC109/DPP細(xì)胞中AKT的磷酸化水平降低，這說明AKT的活化也參與到食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥中，但PPAR-γ如何與AKT相互影響尚不清楚，仍值得深入研究。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了下調(diào)miR-454表達(dá)可增強(qiáng)EC109/DPP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，其作用機(jī)制可能與上調(diào)PPARγ蛋白、下調(diào)AKT蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究可為提高食管癌的臨床精準(zhǔn)治療奠定一定的理論基礎(chǔ)。