馮 欣

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽 473000)

近年來，隨著我國(guó)腫瘤的發(fā)病率和死亡率不斷提升，腫瘤防治研究是當(dāng)前醫(yī)學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容[1]。腫瘤臨床治療失敗的主要原因可能是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生廣泛的耐藥作用，致使腫瘤細(xì)胞逐漸喪失對(duì)結(jié)構(gòu)與藥理作用機(jī)制完全不同的化療藥物的敏感性。尋找多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑是克服腫瘤臨床耐藥、提高腫瘤化療敏感性的關(guān)鍵。我國(guó)中藥資源豐富，其中可能的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑具有多靶點(diǎn)、療效高、不良反應(yīng)少等獨(dú)有的特點(diǎn)，引起研究者的廣泛關(guān)注。丹參酮ⅡA具有廣泛的抗腫瘤活性，參與抑制血管生成、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥等多個(gè)環(huán)節(jié)[2]。研究[3]證明，丹參酮ⅡA亞微乳在體外能夠部分逆轉(zhuǎn)SMMC-7721/VCR的多藥耐藥性，但是其作用機(jī)制尚不清楚，本文模擬臨床常用紫杉醇聯(lián)合5-氟尿嘧啶及順鉑方案，觀察了丹參酮ⅡA亞微乳對(duì)小鼠S180多藥耐藥腹水癌多藥耐藥相關(guān)耐藥蛋白表達(dá)或活性的影響,以探討其干預(yù)化療多藥耐藥的作用和具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑丹參酮ⅡA原料藥(含量：98%，批號(hào)20140227)，四川省廣漢市世享原料藥業(yè)有限公司；丹參酮ⅡA亞微乳，由丹參酮ⅡA、豆卵磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司，藥用口服級(jí))、玉米油、吐溫80和適量純水制成，丹參酮ⅡA濃度100 mg/mL。DMEM培養(yǎng)基，北京Solarbio科技責(zé)任有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；Anne xin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒，南京凱基生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD Biosciences公司；注射用順鉑(批號(hào)：01611611)，山東齊魯制藥廠；5-氟尿嘧啶(批號(hào)：100112)，天津金耀氨基酸有限公司；注射用環(huán)磷酰胺(批號(hào)：080503)，上海華聯(lián)制藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，體質(zhì)量19～24 g，由河南醫(yī)藥科學(xué)研究所提供；小鼠S180腹水癌模型，由河南醫(yī)藥科學(xué)研究所提供。

1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱，法國(guó)Forme公司；680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀、DK-8D型電熱恒溫水槽，上海晶宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；倒置顯微鏡，德國(guó)Leica公司；1-15PK型臺(tái)式高溫冰凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠S180多藥耐藥腹水癌模型的建立[4]在無菌條件下，抽取3只小鼠S180的腹水，置于離心管中，采用無菌生理鹽水將含瘤細(xì)胞密度稀釋至1×107個(gè)/mL，混勻，分別腹腔接種至10只昆明種小鼠(雌雄各5只)，接種體積為0.2 mL。接種24 h后，除正常對(duì)照組外，腹腔注射或灌胃給予多種化療藥物，具體如下：順鉑3 mg/kg，腹腔注射，每周1次；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)和5-氟尿嘧啶各3 mg/kg灌胃，每天1次。待接種第15天，無菌條件下抽取存活小鼠的腹水，進(jìn)行一對(duì)一傳代接種至新的昆明種小鼠腹腔，建立小鼠S180多藥耐藥腹水癌模型。

1.4.2 丹參酮ⅡA亞微乳抑瘤率觀察 1)造模：抽取已建立的小鼠S180多藥耐藥腹水癌模型腹水，采用無菌生理鹽水將含瘤細(xì)胞密度稀釋至1×107個(gè)/mL備用。取40只19～24 g昆明種小鼠，雌雄各20只，將稀釋好的腹水接種于每只小鼠左腋皮下，接種體積為0.2 mL，建立小鼠S180多藥耐藥實(shí)體瘤模型；2)小鼠分組及給藥：隨機(jī)將已建模成功小鼠分為4組，每組10只，即陽性對(duì)照組(經(jīng)腹腔注射CTX 20 mg/kg)，陰性對(duì)照組(經(jīng)腹腔注射無菌生理鹽水0.2 mL/10 g)，丹參酮ⅡA亞微乳大、小劑量組。丹參酮ⅡA亞微乳大、小劑量組給予相應(yīng)濃度的丹參酮ⅡA亞微乳0.2 mL/10 g、0.1 mL/10 g，腹腔注射，每天給1次，共2周；3)計(jì)算丹參酮ⅡA亞微乳抑瘤率：末次給藥24 h之后，將小鼠實(shí)施安樂死，剝離腫瘤組織，稱其體質(zhì)量，記錄瘤質(zhì)量，按照以下公式計(jì)算抑瘤率：(對(duì)照組瘤質(zhì)量-藥物組瘤質(zhì)量)/對(duì)照組瘤質(zhì)量×100%；藥物對(duì)抑瘤作用的提高率按照以下公式進(jìn)行計(jì)劃：(藥物組抑瘤率-對(duì)照組抑瘤率)/對(duì)照組抑瘤率×100%。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)丹參酮ⅡA亞微乳對(duì)SMMC-7721/VCR細(xì)胞凋亡的影響 選取無細(xì)胞毒性作用的0.5 μg/mL丹參酮ⅡA亞微乳分別作用于SMMC-7721/VCR細(xì)胞24 h、48 h、72 h，每組均設(shè)有陰性對(duì)照。藥物處理結(jié)束后，用不含乙二胺四乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%預(yù)冷胰酶消化各組細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，800 r/min，離心5 min，棄上清液留細(xì)胞。向離心管中加入約5 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，反復(fù)輕柔吹打，混勻，800 r/min，離心5 min，重復(fù)2次，棄去上清液留取底部細(xì)胞。按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)前處理：將收集得到的藥物處理后的細(xì)胞，加入適量Binding Buffer液，輕柔吹打，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度凋整至(1～5)×106個(gè)/mL。取500 μL細(xì)胞懸液至EP管中，分別依次加入Annexin V-FITC和PI各5 μL輕柔吹打，混勻，置于室溫，避光反應(yīng)15 min。將獲得的細(xì)胞懸液于200目尼龍網(wǎng)過濾，轉(zhuǎn)移至流式檢測(cè)管中，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀，檢測(cè)各組細(xì)胞不同時(shí)期的細(xì)胞凋亡率，記錄丹參酮ⅡA亞微乳作用下早期細(xì)胞凋亡率。采用以下條件進(jìn)行檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)=525 nm，通過BD FACSDiva軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)丹參酮ⅡA亞微乳對(duì)耐藥細(xì)胞膜表面耐藥相關(guān)蛋白P-gp表達(dá)的影響 將SMMC-7721、SMMC-7721/VCR細(xì)胞接種至6孔板，接種密度為2×105個(gè)/孔，24 h后待細(xì)胞貼壁后，于SMMC-7721/VCR細(xì)胞中加入0.5 μg/mL丹參酮ⅡA，以不加丹參酮ⅡA的SMMC-7721、SMMC-7721/VCR細(xì)胞作為陰性對(duì)照。作用48 h后，按照2.3中流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理方法收集消化細(xì)胞、離心、預(yù)冷PBS洗2遍，棄上清留細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的預(yù)冷PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整至(1～5)×105個(gè)/mL，輕柔吹打混勻，取細(xì)胞懸液90 μL，加入10 μL鼠抗人P-gp抗體，反復(fù)輕柔吹打，使細(xì)胞充分混勻，置于 4 ℃冰箱孵育30 min。取出細(xì)胞，離心，棄上清，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的預(yù)冷PBS反復(fù)洗3次，從而除去未與蛋白結(jié)合的游離抗體。離心，棄上清，500 μL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞處理整個(gè)過程應(yīng)于冰上進(jìn)行。取200目尼龍網(wǎng)過濾的細(xì)胞懸液置于流式檢測(cè)管中，按照2.3中條件設(shè)置流式細(xì)胞儀參數(shù)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢測(cè)到的P-gp熒光強(qiáng)度反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)P-gp含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 羅丹明外排實(shí)驗(yàn) 羅丹明作為P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)底物能較好代表其轉(zhuǎn)運(yùn)功能[5-6]，因此，為了檢測(cè)丹參酮ⅡA對(duì)SMMC-7721/VCR細(xì)胞P-gp的影響是否與轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)，我們進(jìn)行了羅丹明外排實(shí)驗(yàn)。將SMMC-7721/VCR細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于24孔培養(yǎng)板，24 h待細(xì)胞貼壁后，吸棄上清液，PBS洗2次，加入終濃度為5 μg/mL的羅丹明于37 ℃孵育30 min，棄去上清，加入丹參酮ⅡA亞微乳至終濃度為0.5 μg/mL，對(duì)照組更換成新鮮培養(yǎng)基，分別于0、0.5、1、2 h收取細(xì)胞。收集方法參照2.3，離心后棄上清，加入500 μL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)540～660 nm，細(xì)胞內(nèi)羅丹明濃度以熒光強(qiáng)度平均值表示。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA亞微乳對(duì)小鼠多藥耐藥模型抑瘤率的影響與陰性對(duì)照組及陽性對(duì)照CTX組比較，丹參酮ⅡA亞微乳作用后，實(shí)體瘤質(zhì)量顯著降低，抑瘤率明顯提高(P均<0.05)。見表1。

表1 丹參酮ⅡA亞微乳對(duì)小鼠多藥耐藥模型抑瘤率的影響

2.2 丹參酮ⅡA亞微乳誘導(dǎo)發(fā)生早期細(xì)胞凋亡情況0.5 μg/mL丹參酮ⅡA亞微乳作用SMMC-7721/VCR細(xì)胞24、48、72 h后,早期細(xì)胞凋亡率隨丹參酮ⅡA亞微乳作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且實(shí)驗(yàn)組較陰性對(duì)照組明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 丹參酮ⅡA亞微乳作用不同時(shí)間段SMMC-7721/VCR早期細(xì)胞凋亡率 %

2.3 丹參酮ⅡA亞微乳抑制多藥耐藥細(xì)胞膜表面P-gp情況SMMC-7721細(xì)胞P-gp相對(duì)含量明顯低于SMMC-7721/VCR細(xì)胞，SMMC-7721/VCR+丹參酮ⅡA亞微乳細(xì)胞(0.5 μg/mL丹參酮ⅡA亞微乳作用48 h后)，細(xì)胞膜表面P-gp相對(duì)表達(dá)量與SMMC-7721/VCR細(xì)胞比較，有一定程度的降低，但仍高于SMMC-7721細(xì)胞(P均<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞膜表面P-gp相對(duì)量比較

2.4 丹參酮ⅡA抑制SMMC-7721/VCR細(xì)胞內(nèi)羅丹明外排情況丹參酮ⅡA亞微乳組羅丹明濃度在每個(gè)時(shí)間段均顯著高于丹參酮ⅡA組，提示丹參酮ⅡA亞微乳可以明顯抑制細(xì)胞內(nèi)羅丹明的外排(P均<0.05)。見圖1。

圖1 羅丹明外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)果表明，丹參酮ⅡA亞微乳能提高對(duì)小鼠S180多藥耐藥實(shí)體瘤的抑瘤率，并且隨著濃度的升高，抑瘤率有所提高，這說明丹參酮ⅡA亞微乳能逆轉(zhuǎn)小鼠S180腫瘤獲得性多藥耐藥。目前，已知腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)制多樣且復(fù)雜，P-gp具有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增高、功能活躍的特點(diǎn)，是化療耐藥的經(jīng)典機(jī)制[7]。P-gp具有生物膜泵功能，可以將細(xì)胞內(nèi)藥物泵至細(xì)胞膜外，從而降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度[8-9]。通過檢測(cè)丹參酮ⅡA亞微乳對(duì)P-gp表達(dá)的影響以及羅丹明外排的研究發(fā)現(xiàn)，抑制P-gp的外泵功能是其機(jī)制之一[10]。除此之外，流式細(xì)胞儀檢測(cè)丹參酮ⅡA亞微乳對(duì)SMMC-7721/VCR細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)表明逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥機(jī)制可能與其提高耐藥細(xì)胞早期細(xì)胞凋亡率有關(guān)。通過本研究可以看出，運(yùn)用丹參酮ⅡA亞微乳逆轉(zhuǎn)多藥耐藥有廣泛應(yīng)用前景。我們由此推測(cè)出，丹參酮ⅡA亞微乳可以使細(xì)胞膜表面P-gp的含量降低，P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，腫瘤細(xì)胞對(duì)相關(guān)化療藥物的外排作用明顯減少，細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度提高，可以部分逆轉(zhuǎn)SMMC-7721/VCR的多藥耐藥性。本實(shí)驗(yàn)僅初步研究了丹參酮ⅡA亞微乳對(duì)P-gp表達(dá)的影響及多藥耐藥對(duì)耐藥細(xì)胞早期凋亡的影響，下一步我們將繼續(xù)探索丹參酮ⅡA亞微乳逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用及具體機(jī)制。