馬敬南，?？?，陳苗苗，文 為，張修華，王升富

(湖北大學化學與化工學院，有機功能分子合成與應用教育部重點實驗室，湖北武漢 430062)

納米酶是一類具有類酶催化活性的納米催化劑[1]。針對天然酶固有的穩(wěn)定性差、成本高、回收率低等不足，具有高穩(wěn)定性、低成本等優(yōu)勢的納米酶近年來受到越來越多的關注，并廣泛應用于生物傳感、癌癥治療、環(huán)境監(jiān)測等多個領域[2]。目前大量研究表明，通過增大比表面積、豐富活性位點、表面功能化等多種途徑，可開發(fā)多種催化性能優(yōu)異的納米酶，如碳納米酶[3]、金屬納米酶[4]、金屬氧化物納米酶[5]等等。但是這些納米酶大多以雜原子摻雜、表面活性基團調控、改變形貌或尺寸等手段來增強納米酶的催化活性，而通過引入天然酶活性中心的納米酶目前鮮見報道，有待深入研究。

金屬有機框架(MOFs)是一種由金屬基節(jié)點(金屬離子或簇)與有機配體連接而成的晶體多孔雜化物[6]。由于MOFs具有較大的比表面積、可調的孔隙大小以及優(yōu)異的吸附性能，使其在光/電催化、傳感檢測等領域顯示了獨特優(yōu)勢。采用不同金屬基節(jié)點和有機配體為原料可以合成特定性能的MOFs，這為實現(xiàn)MOFs納米酶模擬過氧化物酶活性提供了可能。其中，卟啉及其衍生物是一些MOFs合成的重要原料(如Fe-MOF[7]、鋯卟啉MOF[8])，因卟啉環(huán)的中心可與金屬離子結合，可形成具有開放金屬位點的框架結構，使其具有與天然酶活性中心高度相似的結構。因此，對以具有過氧化物酶活性中心為配體的MOFs納米酶催化性能與檢測應用的研究具有重要意義。

H2O2是許多酶促反應的重要產物或中間產物，保持合適的H2O2濃度對維持正常的細胞生理活性至關重要。基于此，本文在堿性環(huán)境下將5，10，15，20-四(4-羧基苯基)卟啉和六水合氯化鐵通過溶劑熱反應合成了新型MOFs納米酶MIL-141(Fe)(MIL代表Material from Institute Lavoisier，其中Fe(Ⅲ)或Ni(Ⅱ)作為金屬節(jié)點以及卟啉類化合物作為有機配體[9])，并驗證了其良好的類酶催化活性。在此基礎上，構建了TMB-H2O2比色傳感體系，并系統(tǒng)地研究了MIL-141(Fe)對體系的催化顯色機理，實現(xiàn)了對H2O2的快速定量分析檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

UV-2700型紫外可見分光光度計(日本，Shimadzu)；SC-05型熒光分光光度計(英國，愛丁堡)；Shimadzu-XRD 6100 X射線(粉末)衍射儀(日本，Shimadzu)；ESCALAB 250Xi型X射線光電子能譜儀，Sigma 500場發(fā)射掃描電子顯微鏡(德國，德國卡爾蔡司公司)；JEM-100SX型透射電子顯微鏡(日本，JEOL)；NICOLET iS10型傅里葉紅外光譜儀(美國，Thermo Scientific)；AWJ1-0501-U型超純水儀(美國，艾科浦)。

FeCl3·6H2O、NaOH、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、HAc、丙酮，均購于國藥試劑化學有限公司；5，10，15，20-四(4-羧基苯基)卟啉(H2TCPP)購于Frontier Science有限公司；對苯二甲酸(PTA)、H2O2、NaAc等購于Aladdin試劑有限公司。實驗中所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水(18.25 MΩ·cm)。

1.2 MIL-141(Fe)納米酶的制備

根據(jù)文獻報道方法[9]合成MIL-141(Fe)納米酶的步驟如下：首先將45 mg H2TCPP和25 mg FeCl3·6H2O加入5 mL DMF中充分攪拌混合，再加入50 μL濃度為1 mol/L的NaOH溶液，室溫下攪拌5 min后，放置于50 mL聚四氟乙烯高壓反應釜中，在烘箱中于160 ℃下反應12 h。冷卻至室溫后將合成的樣品取出，加入2 mL DMF于反應釜中，清洗附著的產物，離心10 min(10 000 r/min)去除紅色上清液，用DMF、丙酮連續(xù)洗滌三次，充分收集反應產物。在合成過程中，NaOH溶液提供堿性環(huán)境，輔助獲得結晶材料。將上述得到的MIL-141(Fe)置于150 ℃真空干燥箱中干燥過夜，冷卻至室溫，儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MIL-141(Fe)納米酶的動力學分析

將制備好的MIL-141(Fe)納米酶配制成濃度為1 mg/mL的溶液。將10 μL 1 mg/mL MIL-141(Fe)和不同濃度的H2O2或TMB(0.1～0.6 mmol/L)加入至NaAc-HAc緩沖溶液(pH=4)中充分混合，反應總體積為3 mL。在紫外-可見分光光度計的時間掃描模式下對其進行動力學分析測定，監(jiān)測波長652 nm處溶液吸收度的變化，間隔時間設為400 s。實驗結果采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法分別計算求得Km和Vmax。

1.4 MIL-141(Fe)納米酶催化反應中間體的測定

將20 μL 1 mg/mL MIL-141(Fe)溶液、100 μL 90 mmol/L H2O2和50 μL 30 mmol/L PTA溶液加入至NaAc-HAc緩沖溶液(pH=4)中，總體積為3 mL，并使其充分混合。PTA作為熒光探針，設定315 nm為激發(fā)光波長，狹縫寬度均為3.5 nm，測量上述混合溶液在390～550 nm波長范圍內的熒光信號。

1.5 H2O2的比色傳感檢測

由于MIL-141(Fe)具有類過氧化物酶活性，以TMB作為底物，加入H2O2產生藍色顯色反應。分別取20 μL 1 mg/mL MIL-141(Fe)溶液、30 μL 30 mmol/L TMB溶液和不同濃度的H2O2，加入0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液(pH=4)中，使反應總體積為3 mL，并混合均勻。上述溶液室溫反應10 min后，用紫外-可見分光光度計測量在550～750 nm波長范圍內吸光度的變化情況，選取652 nm處吸收峰的數(shù)值與所測H2O2濃度之間建立線性關系。

2 結果與討論

2.1 MIL-141(Fe)納米酶的表征

首先，采用掃描電鏡(SEM)(圖1A)和透射電鏡(TEM)(圖1B)對合成的MIL-141(Fe)納米酶的形貌進行了表征。由圖可知，MIL-141(Fe)呈規(guī)則的棒狀結構，長度在700～1 300 nm之間。為了證明其結晶性質，采用X射線粉末衍射(XRD)進一步表征。如圖1C所示，所合成的MIL-141(Fe)呈現(xiàn)出(110)、(002)和(004)等晶面的特征峰，與文獻報道一致[9]，證明了其具有較高的結晶度。

圖1 MIL-141(Fe)的掃描電鏡(SEM)圖像(A)、TEM圖像(B)和XRD圖譜(C)Fig.1 TEM image(A),SEM image(B) and XRD spectrum(C) of MIL-141(Fe)

在MOFs納米酶合成過程中，首先在堿性條件促使羧基化卟啉去質子化與Fe(Ⅲ)離子形成類血紅素結構的鐵卟啉配體；然后Fe(Ⅲ)離子與鐵卟啉配體的四個羧基相配位形成pts型骨架；最后通過自組裝形成獨特、有序且多孔的MIL-141(Fe)納米酶。為了驗證此MOFs是否成功合成，采用紫外-可見吸收光譜法對形成MIL-141(Fe)納米酶前后配體H2TCPP的光學性質變化過程進行了探究。如圖2A所示，配體H2TCPP中卟啉環(huán)的Soret帶特征吸收峰位于419 nm處，而在MIL-141(Fe)中它的位置發(fā)生了輕微的藍移(411 nm)。此外，在510～650 nm波長范圍內配體H2TCPP有4個Q帶，而形成MIL-141(Fe)后只在570 nm和609 nm處顯示了兩個主要的Q帶，這說明該材料在形成過程中，卟啉環(huán)結構的對稱性可能發(fā)生了改變，推測是由于Fe(Ⅲ)離子與卟啉環(huán)中心形成配位鍵導致的[10]。

采用傅里葉變換紅外光譜進一步研究了配體H2TCPP在形成MIL-141(Fe)納米酶前后的基團變化情況。如圖2B，MIL-141(Fe)在1 600 cm-1和1 400 cm-1處的吸收峰分別歸屬于羧酸鹽中C=O的反對稱伸縮振動和對稱伸縮振動，在1 570 cm-1處的吸收峰是由于卟啉環(huán)中C=C的存在。值得注意的是，與配體H2TCPP(1 330 cm-1)相比，MIL-141(Fe)的卟啉環(huán)中C=N伸縮振動吸收偏移至1 270 cm-1處，且強度明顯增強[10]，說明了配位鍵的形成。此外，870 cm-1處新出現(xiàn)的Fe-O振動吸收峰，進一步說明Fe-O 鍵的形成。

圖2 H2TCPP、MIL-141(Fe)的紫外-可見(UV-Vis)光譜圖(A)和傅里葉變換紅外(FTIR)光譜圖(B)Fig.2 UV-Vis spectra(A) and FTIR spectra(B) of H2TCPP and MIL-141(Fe)

采用X射線光電子能譜(XPS)對MIL-141(Fe)中的元素成分進行分析。MIL-141(Fe)的XPS全譜圖(圖3A)證明了合成的MIL-141(Fe)中C、N、O和Fe四種主要元素的存在。高分辨XPS譜進一步討論了各種元素的存在形式。如圖3B所示，位于710.4 eV和724.0 eV的兩個峰分別對應Fe 2p3/2和Fe 2p1/2結合能[11]，說明元素Fe以三價的形式存在。如圖3C所示，O 1s的兩個峰位于530.8 eV和532.1 eV，分別對應MIL-141(Fe)中卟啉環(huán)的C=O和C-OH基團。以上結果充分證明了MIL-141(Fe)的成功合成。

圖3 MIL-141(Fe)的XPS譜圖：全測量譜圖(A),Fe 2p(B),O 1s(C)Fig.3 XPS spectrum of MIL-141(Fe):Full survey spectrum(A),Fe 2p(B),O 1s(C)

2.2 MIL-141(Fe)納米酶動力學分析

以TMB和H2O2為底物，通過改變混合物中一種底物濃度同時保持另一種底物濃度恒定，測定反應的表觀穩(wěn)態(tài)動力學參數(shù)，對MIL-141(Fe)納米酶的過氧化物酶活性進行研究。計算各種初始反應速率并將其應用于Michaelis-Menten動力學方程：

1/v=(Km/Vmax)·(1/[S])+1/Vmax

(1)

其中：v是反應初始速度，Vmax是最大反應速率，Km是米氏常數(shù)，[S]代表底物濃度。

運用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法(1/[S]～1/v)，Km和Vmax值分別由斜率與截距計算得到。Km值反映酶對底物親和力，Km值越小，酶對底物的親和力越強。隨著H2O2底物濃度的增大，反應速度顯著增強(圖4A)，從而計算得到MIL-141(Fe)的Km值和Vmax分別為1.01 mmol/L和21.44×10-8mol/(L·s)(圖4B)；同理改變TMB底物濃度時，反應速率加快(圖4C)，相應的Km值和Vmax分別為0.15 mmol/L和4.90×10-8mol/(L·s)(圖4B)。兩種情況下的Km值均低于文獻[5]報道的辣根過氧化物酶(HRP)的Km值，證明MIL-141(Fe)納米酶對TMB和H2O2均具有很好的親和力，為后續(xù)基于TMB和H2O2比色體系的構建提供了有利條件。

圖4 MIL-141(Fe)納米酶模擬過氧化物酶的動力學分析。(A)保持TMB (0.5 mmol/L)濃度不變，H2O2濃度變化;(C)保持 H2O2(30 mmol/L)濃度不變，TMB濃度變化；(B)和(D)是(A)和(C)對應的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖。Fig.4 Steady-state kinetic analysis of MIL-141(Fe).(A)Keep the concentration of TMB unchanged(0.5 mmol/L) with a varying concentration of H2O2 ;(C)Keep the concentration of H2O2 unchanged(30 mmol/L) with a varying concentration of TMB;(B) and(D) are the corresponding Lineweaver-Burk plots of(A) and(C).

2.3 MIL-141(Fe)納米酶催化性能及其機理研究

通過對比加入H2O2前后MIL-141(Fe)催化氧化TMB溶液的吸光度變化情況，驗證MIL-141(Fe)是否具有類過氧化物酶活性。結果如圖5A所示，控制對照組H2O2-TMB(曲線a)、H2O2-MIL-141(Fe)(曲線b)、TMB-MIL-141(Fe)(曲線c)的溶液均無明顯顏色變化。只有在MIL-141(Fe)納米酶、H2O2和TMB三者同時存在時，反應體系溶液才變?yōu)樯钏{色，在652 nm處吸收峰強度顯著增強，進一步說明合成的MIL-141(Fe)納米酶具有良好的類過氧化物酶活性，催化H2O2氧化TMB生成藍色產物。為了探究MIL-141(Fe)納米酶的催化機理，選用對苯二甲酸(PTA)作為·OH捕獲劑，檢測催化反應過程中產生的·OH 中間體。實驗結果表明，隨著納米酶催化反應時間的增加，反應體系在435 nm處熒光強度逐漸增強(圖5B)。由于PTA分子捕獲·OH后會生成2-羥基對苯二甲酸，從而發(fā)出獨特的熒光[12]，因此說明了MIL-141(Fe)納米酶催化過程中可持續(xù)產生大量的·OH，這與納米酶的催化機理相一致[13]。

圖5 (A)不同反應條件下溶液顏色變化(插圖)及其在652 nm處吸光度變化：H2O2-TMB(曲線a)，H2O2-MIL-141(Fe)(曲線b)，TMB-MIL-141(Fe)(曲線c)和H2O2-TMB-MIL-141(Fe)(曲線d)；(B)PTA-H2O2-MIL-141(Fe)反應系統(tǒng)在不同的反應時間條件下的熒光光譜Fig.5 (A)Under different reaction conditions,the absorbance changes at 652 nm:H2O2-TMB(curve a),H2O2-MIL-141(Fe)(curve b),TMB-MIL-141(Fe)(curve c) and H2O2-TMB-MIL-141(Fe)(curve d)(Inset:a,b,c and d correspond to the color change image of the solution);(B)Fluorescence spectra of PTA-H2O2-MIL-141(Fe) reaction system under different reaction time

2.4 H2O2比色檢測

鑒于MIL-141(Fe)納米酶良好的催化性能和快速響應能力，構建了比色傳感體系對不同濃度H2O2溶液進行定量分析檢測。如圖6A所示，隨著H2O2濃度的增大，TMB-MIL-141(Fe)體系在652 nm處吸收峰逐漸增強，且在1～150 μmol/L濃度范圍內二者呈現(xiàn)良好的線性關系，線性方程為：A=0.00176c+0.0194(R2=0.9976)，檢測限(3σ/k)為0.60 μmol/L。與其他方法的結果進行比較(表1)，本文構建的檢測方法分析性能良好，具有響應快速、簡便易操作、靈敏準確等特點。

圖6 不同H2O2濃度(1，2，5，10，20，50，70，100，150 μmol/L)條件下，傳感器在652 nm處的吸光度變化(A)及對應的線性關系曲線(B)Fig.6 Absorbance change(A) and corresponding linear standard curve of absorbance change(B) at 652 nm under different H2O2 concentration(1，2，5，10，20，50，70，100，150 μmol/L)

表1 本方法與其它檢測H2O2方法的性能比較Table 1 Comparison of this method withotherassays for H2O2 detection

2.5 比色傳感器性能評估

為了探究基于MIL-141(Fe)納米酶構建的比色傳感器檢測H2O2的重現(xiàn)性，在相同實驗條件下，對50 μmol/L H2O2進行了6次平行測定。結果如圖7A所示，檢測所得吸光度值的相對活性結果保持高度一致，相對標準偏差(RSD)為0.14%。此外，將此傳感器用于濃度為1 mmol/L(高于目標物H2O2濃度20倍)的金屬離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Al3+以及葡萄糖的檢測，均無明顯響應(圖7B)。上述實驗結果證明該傳感器對H2O2的檢測具有良好的重現(xiàn)性和選擇性。

圖7 基于MIL-141(Fe)比色傳感器的重現(xiàn)性(A)和選擇性(B)Fig.7 Reproducibility(A) and selectivity(B) of the colorimetric sensor based on MIL-141(Fe)(A):test number;(B):blank(a),Na+(b),K+(c),Ca2+(d),Mg2+(e),Zn2+(f),Al3+(g),glucose(h) and 50 μmol/L H2O2(i)，containing 3 mmol/L TMB,20 μL 1 mg/mL MIL-141(Fe) and response time is 10 min.

2.6 實際自來水樣品檢測

為了評估基于MIL-141(Fe)納米酶的比色傳感器在實際樣品中的檢測能力，實驗采用標準加入法測定自來水中H2O2的濃度。結果如表2所示，回收率在101.8%～105.0%之間，表明該傳感方法檢測結果準確可靠，有望用于實際樣品的現(xiàn)場即時分析。

表2 自來水樣品中H2O2的測定結果Table 2 Results of determination of H2O2 in tap water sample

3 結論

本文合成了具有良好催化性能金屬有機框架納米酶MIL-141(Fe)，并將其應用于水溶液中高效催化H2O2氧化TMB顯色，從而實現(xiàn)了H2O2的比色定量分析。實驗證明MIL-141(Fe)中Fe(Ⅲ)離子與卟啉環(huán)之間的配位作用可生成具有類血紅素結構的鐵卟啉配體，不僅為其提供了與天然過氧化物酶相類似的活性位點，且對TMB和H2O2表現(xiàn)出更高的親和力和較快的響應速率。該方法重現(xiàn)性好、選擇性高且快速簡便，為實際樣品中H2O2的現(xiàn)場檢測提供了新的思路。