夏 翠 祝 康 鄭國璽 孫 斌 高天喜 趙 健

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種常見的異質(zhì)性慢性上呼吸道疾病，是一種IgE介導(dǎo)的炎癥[1]。在AR過敏反應(yīng)中，當(dāng)變應(yīng)原與IgE相互作用時，肥大細胞會激活[2]?？乖?IgE刺激后，肥大細胞釋放細胞因子介導(dǎo)急性和慢性炎癥[3]。Jagged1是Notch信號中Notch配體之一，AR發(fā)病過程中Jagged1的表達明顯增加，Notch1-Jagged1可能通過上調(diào)IL-6和IL-10的表達促進AR的發(fā)生和發(fā)展[4]。據(jù)報道，敲低Jagged1可抑制肥大細胞產(chǎn)生促炎性細胞因子[5]。在過敏性疾病中，呼吸道黏膜肥大細胞數(shù)量顯著增加，上皮細胞表達的Notch配體可通過增加該細胞產(chǎn)生促炎性細胞因子，促進炎癥的進展[6，7]。因此，在炎性組織中阻斷Jagged1可能是治療過敏性疾病的一種新策略。綜上所述，本研究旨在探究Jagged1通過調(diào)控肥大細胞遷移、浸潤和脫顆粒對變應(yīng)性鼻炎小鼠的影響，以期為變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機制的探究及開發(fā)新的治療策略提供新的科學(xué)資料。

材料與方法

1.材料：卵清蛋白和氫氧化鋁購自美國Sigma Chemical公司；Trizol reagent、PrimeScriptTMRT reagen Kit with gDNA Eraser和SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒購自日本TaKaRa公司；Jagged1和GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；shRNA陰性對照慢病毒液(sh-NC)和Jagged1 shRNA慢病毒(sh-Jagged1)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；組胺(HIS)、類胰蛋白酶(TPS)、前列腺素D2(PGD2)和小鼠卵清蛋白特異性IgE抗體(OVA-sIgE)ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

2.動物飼養(yǎng)：32只6～8周齡SPF級BALB/c小鼠購自湖南SJA實驗動物有限公司。所有動物飼養(yǎng)于鼠房，保持室內(nèi)通風(fēng)，確保充足飲水及飼料。

3.變應(yīng)性鼻炎小鼠模型的建立：32只小鼠隨機分為4組：對照組、AR組、sh-NC組和sh-Jagged1組，每組各8只。AR組、sh-NC組和sh-Jagged1組小鼠在建模第1、8和15天腹腔注射100μg OVA，在第21～27天，每天用20μl OVA溶液鼻腔給藥進行兩次局部激發(fā)。對照組給予小鼠等量0.9%NaCl濃度。

4.Jagged1慢病毒干擾：在建模第1、7、14天和第21～27天每次激發(fā)前3h，AR組、sh-NC組和sh-Jagged1組小鼠分別經(jīng)鼻給予20μl PBS、sh-NC慢病毒液和sh-Jagged1慢病毒液，對照組給予小鼠等量0.9%NaCl濃度。

5.鼻部癥狀評價及取樣：在最后一次使用OVA進行局部激發(fā)后，對各組小鼠進行鼻部癥狀評分[8]。當(dāng)癥狀評分>5時，AR小鼠模型被認為造模成功。癥狀評分結(jié)束后，處死各組小鼠，收集骨髓，外周血和鼻黏膜并保存在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6.RT-PCR法：取各組小鼠骨髓，外周血和鼻黏膜，Trizol法提取各樣品總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，每組設(shè)置3個重復(fù)。Jagged1上游引物：5′-CTTCAATCTCAAGGCCAGCC-3′,下游引物：5′-CAGGCGAAACTGAAAGGCAG-3′；GAPDH上游引物：5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′,下游引物：5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3′。反應(yīng)條件為95℃ 30s,95℃ 5s，60℃ 30s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算Jagged1 mRNA表達。

7.Western blot法：收集各組小鼠骨髓，外周血細胞和鼻黏膜，RIPA裂解液裂解各樣品，BCA法測定上清液蛋白濃度。10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2h。一抗Jagged1 抗體(1∶5000)和GAPDH抗體(1∶10000)于4℃條件下孵育過夜，二抗室溫下孵育1h。ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑盒和化學(xué)發(fā)光成像儀檢測蛋白條帶。

8.HE染色和甲苯胺藍染色：用0.9%NaCl溶液沖洗小鼠鼻黏膜組織，10%多聚甲醛固定。常規(guī)石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟至水，蘇木精、伊紅染色或0.1%甲苯胺藍液染色，光鏡下觀察其組織學(xué)變化。

9.電子顯微鏡分析：將小鼠鼻黏膜組織切成約1mm×1mm×1mm大小。4℃的2.5%戊二醛處理4h，1%四氯化銫中固定2h。常規(guī)脫水、組織包埋、超薄切片，2%醋酸鈾染色，檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察。

10.ELISA實驗：各組小鼠外周血，1000×g離心10min收集血清。按ELISA試劑盒說明書，測定黏膜，骨髓和血清中組胺、類胰蛋白酶、PGD2和血清中OVA特異性免疫球蛋白E(IgE)含量。

結(jié) 果

1.Jagged1 shRNA慢病毒對AR小鼠Jagged1 mRNA水平的影響：RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，AR組和sh-NC組小鼠骨髓、外周血和鼻黏膜中Jagged1 mRNA水平均升高(P<0.01，圖1)；與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠骨髓，外周血和鼻黏膜中Jagged1 mRNA水平均降低(P<0.01，圖1)。

圖1 Jagged1 shRNA慢病毒對AR小鼠Jagged1 mRNA水平的影響A.各組小鼠骨髓中Jagged1 mRNA水平；B.各組小鼠外周血中Jagged1 mRNA水平；C.各組小鼠鼻黏膜中Jagged1 mRNA水平；與對照組比較，*P<0.01，**P=0.000；與sh-NC組比較，#P<0.01

2.Jagged1 shRNA慢病毒對AR小鼠Jagged1蛋白水平的影響：Western blot法結(jié)果顯示，與對照組比較，AR組和sh-NC組小鼠骨髓、外周血和鼻黏膜中Jagged1 蛋白水平均升高(P=0.000，圖2)；與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠骨髓，外周血和鼻黏膜中Jagged1蛋白水平均降低(P<0.01，圖2)。

圖2 Jagged1 shRNA慢病毒對AR小鼠Jagged1蛋白水平的影響A.各組小鼠骨髓中Jagged1蛋白水平；B.各組小鼠外周血中Jagged1蛋白水平；C.各組小鼠鼻黏膜中Jagged1 蛋白水平；與對照組比較，*P=0.000；與sh-NC組比較，#P<0.01，##P=0.000

3.Jagged1 shRNA慢病毒對AR小鼠模型鼻癥狀和OVA特異性IgE的影響：各組小鼠鼻部癥狀評分和ELISA結(jié)果顯示，與對照組比較，AR組和sh-NC組小鼠癥狀評分升高(P<0.01，圖3A)，且均>5，表明AR小鼠造模成功，OVA特異性IgE表達升高(P<0.01，圖3B)；與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠癥狀評分和OVA特異性IgE表達降低(P<0.01，圖3)。

圖3 Jagged1 shRNA慢病毒對AR小鼠模型鼻癥狀和OVA特異性IgE的影響A.各組小鼠鼻部癥狀評分；B.各組小鼠OVA特異性IgE的表達；與對照組比較，*P<0.01，**P=0.000；與sh-NC組比較，#P<0.01

4.Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠鼻黏膜組織病理學(xué)變化的影響：HE染色結(jié)果顯示，與對照組比較，AR組和sh-NC組小鼠的鼻中隔黏膜基膜破碎，黏膜下血管出現(xiàn)明顯擴張、充血現(xiàn)象，出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤(P<0.01)。與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠的鼻中隔黏膜基膜損傷減輕，鼻黏膜水腫和黏膜下血管擴張得到改善，炎性細胞浸潤明顯減少(P<0.05，圖4)。

圖4 HE染色檢測Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠鼻黏膜組織病理學(xué)變化的影響(×400)A.對照組；B.AR組；C.sh-NC組；D.sh-Jagged1組。與對照組比較，*P<0.01；與sh-NC組比較，#P<0.05

圖5 Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠鼻黏膜纖毛結(jié)構(gòu)的影響(×12000)A.對照組；B.AR組；C.sh-NC組；D.sh-Jagged1組

5.Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠鼻黏膜纖毛結(jié)構(gòu)的影響：電子顯微鏡觀察各組小鼠鼻黏膜的纖毛結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示，在對照組中可以觀察到大量排列整齊、厚度均勻的纖毛，AR組和sh-NC組小鼠鼻黏膜上皮表面分泌物增多，纖毛大面積減少、排列紊亂；與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠鼻黏膜纖毛排列整齊、均勻，分泌物減少。

6.Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠鼻黏膜肥大細胞浸潤的影響：甲苯胺藍染色結(jié)果顯示，與對照組比較，AR組和sh-NC組小鼠的鼻黏膜組織中肥大細胞的數(shù)量明顯升高(P<0.01)；與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠的鼻黏膜組織中肥大細胞的數(shù)量明顯降低(P<0.05，圖6)。

圖6 甲苯胺藍染色檢測Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠鼻黏膜肥大細胞浸潤的影響(×400)A.對照組；B.AR組；C.sh-NC組；D.sh-Jangged1組。與對照組比較，*P<0.01；與sh-NC組比較，#P<0.05

7.Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠肥大細胞脫顆粒的影響：ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，AR組和sh-NC組小鼠骨髓、外周血和鼻黏膜中組胺、類胰蛋白酶和PGD2水平明顯升高(P<0.01，圖7)；與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠骨髓、外周血和鼻黏膜中組胺、類胰蛋白酶和PGD2水平明顯降低(P<0.01，圖7)。

圖7 Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠肥大細胞脫顆粒的影響A.各組小鼠組胺水平；B.各組小鼠類胰蛋白酶水平；C.各組小鼠PGD2水平。與對照組比較，*P<0.01，**P=0.000；與sh-NC組比較，#P<0.01，##P=0.000

討 論

變應(yīng)性鼻炎嚴重干擾患者的日常生活[8]。目前，口服抗組胺藥被認為是治療AR的主要療法。然而，可用的抗組胺藥，可能會導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)。而鼻內(nèi)皮質(zhì)類固醇、白三烯受體拮抗劑和過敏原免疫療法成本高昂，也存在一些不良反應(yīng)[9]。因此，探明AR的發(fā)病機制，尋找更為有效的治療靶點極其重要。

Jagged1是Notch配體之一，據(jù)相關(guān)報道，AR患者的Notch1和Jagged1的表達明顯升高[10]。這與AR進展和變應(yīng)原IgE水平呈正相關(guān)。與AR組比較，抑制Notch表達，可降低AR患者的過敏癥狀、IgE水平及Notch1、Jagged1的表達。Notch信號可促進AR的發(fā)生、發(fā)展[11]。橘皮素通過抑制其表達減輕變應(yīng)性鼻炎癥狀，降低血清OVA誘導(dǎo)IgE的產(chǎn)生[12]。本研究結(jié)果顯示，Jagged1 RNA干擾可改善AR小鼠癥狀、鼻黏膜病理學(xué)變化和鼻纖毛結(jié)構(gòu)損傷，抑制IgE的產(chǎn)生。該研究結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致。

相關(guān)實驗證明，在過敏性鼻炎反應(yīng)早期，組胺能削弱上皮細胞的屏障功能，增強致病作用[13]。芍藥苷通過抑制組胺釋放而在活化的肥大細胞中發(fā)揮抗過敏作用[14]。前列腺素如PGD2也可導(dǎo)致血管擴張引起鼻水腫，增加血管通透性[15]。此外，已有證據(jù)顯示，在食物過敏小鼠模型中，敲低Jagged1可抑制食物抗原誘導(dǎo)的腸道肥大細胞增生，從而減輕過敏反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果顯示，慢病毒介導(dǎo)的Jagged1 shRNA可降低變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻黏膜中肥大細胞數(shù)量，抑制組胺、類胰蛋白酶和PGD2的釋放，以上結(jié)果表明，敲低Jagged1可抑制變應(yīng)性小鼠肥大細胞遷移、浸潤和脫顆粒。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的Jagged1 RNA干擾可能通過抑制肥大細胞遷移、浸潤和脫顆粒減輕變應(yīng)性鼻炎小鼠的炎癥。該結(jié)果為治療變應(yīng)性鼻炎提供了新的可能靶點，為開發(fā)新療法提供了新的科學(xué)依據(jù)。