李 怡 程 平 余 林 況小寶 曾慶南 黃思遠(yuǎn) 盧玉生

(江西省林業(yè)科學(xué)院 南昌 330013)

植物根際微生物參與植物與土壤間的物質(zhì)循環(huán)，因此其對于植物生長以及土壤生態(tài)環(huán)境有著十分重要的意義[1]。根際微生物能夠通過分泌激素來調(diào)控植物生長代謝，此外它們也可通過多種方式抵御根際有害微生物[2]。植物的根際通過產(chǎn)生分泌物逐漸改變土壤的理化性質(zhì)，進(jìn)而影響根際微生物群落結(jié)構(gòu)，提高植物的抗逆性[3-5]。每種植物都能形成其特異性的根際微生物群落，特別是菌根菌、固氮菌等一些與植物聯(lián)系較為緊密的微生物[6-7]。李菁等[8]研究發(fā)現(xiàn)，3種杓蘭屬植物菌根真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，且指示物種互不相同；葉文雨等[9]研究發(fā)現(xiàn)，2種菌草根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也有較明顯的差異。植物物種間的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)距離越大，根際微生物群落組成差異就越顯著[10]，如農(nóng)澤梅等[11]研究發(fā)現(xiàn)不同甘蔗品種的根際細(xì)菌群落主要差異表現(xiàn)在優(yōu)勢菌屬豐度上。Hartmann等[12]研究幾種豆科植物發(fā)現(xiàn)，豌豆與羽扇豆根際微生物群落結(jié)構(gòu)相似，而與蠶豆卻有顯著差異。

江西省林科院竹種園的竹林成林后施肥量低，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)因施肥所產(chǎn)生的影響較小，故本研究選擇竹種園內(nèi)生長情況良好的剛竹屬竹種，以毛竹、雷竹以及黃稈烏哺雞竹這3個竹種的根際土壤作為研究對象，采用Illumina Hi Seq高通量測序方式對3個竹種的根際微生物群落進(jìn)行分析，通過比較3種不同竹種的根際微生物群落的差異，為竹種專用微生物菌肥的開發(fā)與利用提供研究基礎(chǔ)。

1 試驗地概況

研究試驗地位于江西省林業(yè)科學(xué)院竹種園，地處28°44′41′′N，115°48′46′′E，屬亞熱帶季風(fēng)濕潤型氣候，年平均氣溫19 ℃，年平均降雨量1 713.5 mm。試驗地為紅壤土，土層厚60 cm以上，pH值約4.1～5.0，有機(jī)質(zhì)含量2.0%～3.5%。成林后每年施復(fù)合肥50 kg/667 m2、尿素25 kg/667 m2。林分密度為6 100～9 300株/hm2。

2 研究材料與方法

2.1 研究材料

2019年12月，在江西省林業(yè)科學(xué)院竹種園采集毛竹(Phyllostachysedulis)、雷竹(Ph.praecox)和黃稈烏哺雞竹(Ph.vivaxf.aureocaulis)的根際土壤樣品，挖取15～20 cm左右竹鞭根，用鑰匙將附在根上刮下的土視為根際土壤(剝落分離法)[13]，分別標(biāo)記為毛竹(MR)、雷竹(LR)、黃稈烏哺雞竹(JR)，以附近非竹林土壤作為空白對照(YK)。采樣當(dāng)天將土樣帶回實驗室，過2 mm篩后，置于-80 ℃冰箱保存，供檢測使用。

2.2 土壤樣品測定

1) DNA提取。取0.5 g土壤樣品，用試劑盒提取土壤樣品總DNA。

2) 土壤細(xì)菌、真菌序列的PCR擴(kuò)增及測序。以各土壤樣品微生物總DNA為模板對細(xì)菌16S rRNA V3+V4區(qū)域、nifH功能區(qū)域及真菌ITS1區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。委托上海派森諾生物科技有限公司對PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量分析測序。

2.3 數(shù)據(jù)處理

對序列按相似性≥97%水平進(jìn)行歸類操作及OTU劃分，篩選OTU的代表序列。對OTU結(jié)果應(yīng)用QIIME軟件計算土樣的Alpha多樣性，再利用R語言工具繪制群落結(jié)構(gòu)圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 3個竹種根際土壤微生物OTU水平

在3個竹種根際土壤總DNA的16S rDNA V3+V4區(qū)得到656 203條有效序列，在ITS1區(qū)得到1 225 304條有效序列。

基于相似性≥97%的水平，對樣品的細(xì)菌及真菌有效序列進(jìn)行聚類，如圖1。通過聚類，從3個竹種根際細(xì)菌中共獲得4 512個OTUs，毛竹、雷竹、黃稈烏哺雞竹根際土壤細(xì)菌OTUs數(shù)量分別為2 149、2 449、2 536個，三者特有OTUs數(shù)量分別為635、1 118、815個，三者共有OTUs為723個。竹種根際真菌共獲得922個OTUs，毛竹、雷竹、黃稈烏哺雞竹根際土壤真菌OTUs數(shù)量分別為409、470、421個，三者特有OTUs數(shù)量分別為179、258、193個，三者共有OTUs為86個。可見，根際土壤細(xì)菌OTUs數(shù)量遠(yuǎn)高于真菌。

注：A：細(xì)菌OUT；B：真菌OUT。圖1 竹種根際菌落OTUs分布Venn圖

3.2 3個竹種根際土壤微生物Alpha多樣性

毛竹、雷竹及黃稈烏哺雞竹根際土壤微生物群落多樣性指數(shù)Simpson、Shannon及群落豐富度指數(shù)ACE、Chao1見表1—表3?？梢钥闯觯?個竹種根際土壤細(xì)菌、固氮菌群落的豐富度及多樣性均高于非竹林土壤；土壤真菌的豐富度高于非竹林土壤，而多樣性低于非竹林土壤。其中黃稈哺雞竹根際土壤細(xì)菌豐富度最高，雷竹根際土壤細(xì)菌多樣性最低；雷竹根際土壤真菌豐富度及多樣性均最高，毛竹根際土壤真菌豐富度及多樣性均最低；雷竹根際土壤固氮菌豐富度及多樣性均最高，毛竹根際土壤固氮菌豐富度最低，黃稈哺雞竹根際土壤固氮菌多樣性最低。

表1 不同竹種根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

表2 不同竹種根際土壤真菌多樣性指數(shù)

表3 不同竹種根際土壤固氮菌多樣性指數(shù)

OTU水平及Alpha多樣性指數(shù)都表明根際土壤細(xì)菌群落的豐富度及多樣性都遠(yuǎn)高于真菌，不同竹種間微生物群落存在著一定的獨特性和差異性，黃稈烏哺雞竹根際土壤具有相對更豐富的細(xì)菌群落種類，雷竹根際土壤具有相對更豐富的真菌群落種類。

3.3 3個竹種根際微生物群落組成

3.3.1 根際細(xì)菌群落組成

3個竹種根際土壤細(xì)菌群落在各級分類水平上組分相似，構(gòu)成比例差異不顯著，如圖2。3個竹種優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、酸稈菌門(cidobacteria)，在毛竹根際土壤中占比分別為25.5%、20.2%、23%、20.7%，在雷竹根際土壤中占比分別為34.3%、6.8%、21.4%、28.1%，在黃稈烏哺雞竹根際土壤中占比為28.7%、12.6%、11.9%、32.9%。

圖2 3個竹種根際細(xì)菌在門(左)、綱(中)、目(右)水平上的相對豐度

3個竹種根際土壤優(yōu)勢菌綱均為α-變形稈菌綱(Alphaproteobacteria)及酸稈菌綱(Acidobacteria)，在毛竹根際土壤中占比分別為18.4%、19.5%，在雷竹根際土壤中占比分別為21.7%、19.6%，在黃稈烏哺雞竹根際土壤中占比分別為19.8%、28.4%；毛竹根際土壤優(yōu)勢菌目為根瘤菌目(Rhizobiales)，占比8.2%，雷竹和黃稈烏哺雞竹根際土壤優(yōu)勢菌目為根瘤菌目和酸稈菌目(Acidobacteriales)，占比分別為11.1%、10.7%和8.1%、9.1%；雷竹根際土壤優(yōu)勢菌科為黃色稈菌科(Xanthobacteraceae)。

非竹林土壤與竹種根際土壤比較，細(xì)菌群落組分及構(gòu)成比例差異并不顯著。非竹林土壤優(yōu)勢菌群為變形菌門，α-變形稈菌綱，鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)，鞘脂單胞菌科(Sphingomonas)。其中非竹林土壤根瘤菌目、酸稈菌目及弗蘭克氏菌目(Frankiales)占比遠(yuǎn)低于竹種根際土壤，鞘脂單胞菌目及β-變形菌目(Betaproteobacteriales)占比高于竹種根際土壤。

3.3.2 根際固氮菌群落組成

在3個竹種中，毛竹和雷竹根際土壤固氮菌群落組分及構(gòu)成比例都更接近，如圖3和圖4。毛竹、雷竹及黃稈烏哺雞竹根際土壤主要構(gòu)成菌門為變形菌門、藍(lán)藻(blue-green algae)、厚壁菌門，這與劉彩霞等[14]對毛竹林固氮微生物群落研究結(jié)果一致；3個竹種的優(yōu)勢菌門均為變形菌門，占比分別為97.2%、97.5%、98.2%；在3個竹種中藍(lán)藻在雷竹根際土壤占比最高，厚壁菌門在毛竹根際土壤占比最高，而雷竹不含厚壁菌門；3個竹種的優(yōu)勢菌綱均為α-變形稈菌綱，占比分別為77.2%、86.8%、93.8%，3個竹種中δ-變形菌綱、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、芽孢稈菌綱(Bacilli)在毛竹根際土壤占比均最高，雷竹根際土壤不含芽孢稈菌綱，黃稈烏哺雞竹根際土壤不含δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)；3個竹種的優(yōu)勢菌目均為根瘤菌目，占比分別為76.8%、86%、93.6%，3個竹種中雷竹根際土壤不含芽孢稈菌目，黃稈烏哺雞竹根際土壤不含除硫單胞菌目(Desulfuromonadales)及假單胞菌目(Pseudomonadales)；3竹種的優(yōu)勢菌科均為慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)，占比分別為76.4%、85.2%、89.7%；3竹種的優(yōu)勢菌屬均為慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)，占比分別為76.3%、85.2%、89.7%，黃稈烏哺雞竹相較于毛竹與雷竹無地稈菌屬(Geobacter)與假單胞菌屬(Pseudomonas)，而眉藻屬(Calothrix)也遠(yuǎn)少于毛竹與雷竹。

圖3 3個竹種根際固氮菌在門(左)、綱(中)、目(右)水平上相對豐度

圖4 3個竹種根際固氮菌在科(左)、屬(右)水平上相對豐度

竹種根際土壤與非竹林土壤細(xì)菌群落比較，從綱水平上開始表現(xiàn)出較大差異，非竹林土壤α-變形稈菌綱及其下屬級別占比均遠(yuǎn)低于竹種根際土壤，而δ-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱及他們下屬級占比都高于竹種根際土壤。

3.3.3 根際真菌群落組成

3個竹種根際土壤真菌群落在各級分類水平上組分相似，構(gòu)成比例差異顯著，如圖5和圖6。3個竹種根際土壤主要構(gòu)成菌門為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)，其中毛竹和雷竹根際土壤優(yōu)勢菌門均為子囊菌門，占比分別為83.8%、88.6%；黃稈烏哺雞竹根際土壤優(yōu)勢菌門為擔(dān)子菌門，占比46.8%。毛竹根際土壤優(yōu)勢菌綱為錘舌菌綱(Leotiomycetes)，占比56.3%；雷竹根際土壤優(yōu)勢菌綱為散囊菌綱(Eurotiomycetes)和座囊菌綱(Dothideomycetes)，占比分別為26.4%、32.1%；黃稈烏哺雞竹根際土壤優(yōu)勢菌綱為傘菌綱(Agaricomycetes)，占比43.6%。毛竹根際土壤優(yōu)勢菌目為柔膜菌目(Helotiales)，占比56%，雷竹根際土壤優(yōu)勢菌目為散囊菌目(Eurotiales)，占比26%，黃稈烏哺雞竹根際土壤優(yōu)勢菌目為傘菌目(Agaricales)，占比39.5%。毛竹根際土壤優(yōu)勢菌科為柔膜菌科(Helotiaceae)，占比52.9%，是毛竹特有的菌科；雷竹根際土壤優(yōu)勢菌科為曲霉科(Aspergillaceae)，占比24.1%，占比遠(yuǎn)高于毛竹及黃稈烏哺雞竹根際土壤；黃稈烏哺雞竹根際土壤優(yōu)勢菌科為鵝膏科(Amanitaceae)，占比38.8%，是其特有菌科。毛竹根際土壤優(yōu)勢菌屬為Claussenomyces，占比為52.8%；雷竹根際土壤優(yōu)勢菌屬為青霉菌屬(Penicillium)、曲霉菌屬(Asperquillus)，占比分別為13.5%、10.7%。

圖5 3個竹種根際真菌在門(A)、綱(B)水平上相對豐度

非竹林土壤與竹種根際土壤比較，從門水平上開始表現(xiàn)出較大差異，其被孢霉菌門(8.3%)及其下級分類占比都遠(yuǎn)高于竹種根際土壤；糞殼菌綱(Sordariomycetes)(28.6%)占比也遠(yuǎn)高于竹種根際土壤，而古根菌綱(Archaeorhizomycetes)及銀耳綱(Tremellomycetes)占比則低于竹種根際土壤。

4 討論和結(jié)論

在本研究中根際土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌門與此前本課題組研究的東鄉(xiāng)紅星墾殖場雷竹林[15]、瑞金的毛竹林[16]土壤細(xì)菌群落相一致，同樣以變形菌門、酸稈菌門、放線菌門、綠彎菌門這4個菌門為優(yōu)勢菌門，翟婉璐[17]發(fā)現(xiàn)未覆蓋雷竹林土壤細(xì)菌群落以變形菌門、綠彎菌門、酸稈菌門為優(yōu)勢菌門，這些研究表明竹子這一物種的土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌門具有高度一致性。馮瑋娜等[18]研究發(fā)現(xiàn)，四川牡丹根際細(xì)菌以變形菌門、厚壁菌門(Firmicutes)、酸稈菌門、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)為優(yōu)勢菌門。Lundberg等[19]發(fā)現(xiàn)，在擬南芥根際土壤細(xì)菌以放線菌門、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、變形菌門、擬稈菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門、酸稈菌門為優(yōu)勢菌門。周柳婷等[20]研究發(fā)現(xiàn)連栽木麻黃根際土壤細(xì)菌以酸稈菌門、放線菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門為優(yōu)勢菌門。喬清華[21]研究發(fā)現(xiàn)，棉花根際細(xì)菌以中變形菌門、疣微菌門、浮霉菌門(Planctomycetes)、酸稈菌門、放線菌門、擬稈菌門為優(yōu)勢菌門。綜上可見，不同植物根際細(xì)菌的優(yōu)勢菌門存在一定程度的差異，放線菌門、變形菌門、酸稈菌門是竹類與以上植物間共有的優(yōu)勢菌門，說明這幾個菌門可能是大多數(shù)植物的共同菌門，其中綠彎菌門是竹種較其他植物的特有優(yōu)勢菌門。

對竹種根際土壤與非竹林土壤細(xì)菌群落比較發(fā)現(xiàn)，慢生根瘤菌屬在竹種根際土壤占比顯著高于非竹林土壤，可能由于試驗竹林成林后施肥量低，竹林生長需要一定量的氮，而慢生根瘤菌屬為化能異養(yǎng)菌，可寄生植物根部固定大氣氮，有的也可以游離狀態(tài)固定氮，可為竹林供給一定量的氮，故慢生根瘤菌屬在竹種根際土壤中占比較高。在3個竹種根際土壤真菌群落中青霉菌屬、曲霉菌屬在雷竹根際土壤中占比均最高，且這2個菌屬在3個竹種根際土壤中占比都高于非竹林土壤，可能由于試驗竹林施肥量低，而青霉菌屬、曲霉菌屬作為常見的溶磷真菌，能將土壤中植物難以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，供給竹種利用，故他們在根際土壤中占比高，這一研究發(fā)現(xiàn)為溶磷菌篩選提供了菌株資源，也為后期研制生物肥料提供了理論基礎(chǔ)。

本研究運用Illumina Hi Seq高通量技術(shù)，通過分析毛竹、雷竹及黃稈烏哺雞竹根際微生物(細(xì)菌、真菌、固氮菌)群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明不同竹種根際土壤的微生物群落多樣性具有一定差異性。從3個竹種Alpha多樣性指數(shù)來看，雷竹根際土壤真菌及固氮菌豐富度及多樣性均最高；毛竹根際土壤真菌豐富度及多樣性均最低。從微生物群落組成來看，3個竹種根際土壤細(xì)菌群落在各級分類水平上組分相似，構(gòu)成比例差異不顯著，而非竹林土壤與竹種根際土壤比較，細(xì)菌群落組分及上構(gòu)成比例也并無顯著差異。在3個竹種中，毛竹和雷竹根際土壤固氮菌群落組分及構(gòu)成比例都更接近，非竹林土壤與竹種根際土壤比較，從綱水平上開始表現(xiàn)出較大差異。3個竹種根際土壤真菌群落在各級分類水平上組分相似，構(gòu)成比例差異顯著。綜上初步認(rèn)為，不同竹種的根際微生物群落都有其特異性，因此在生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)竹種的不同，選擇施用合適的高效微生物肥料，促進(jìn)竹種根際土壤優(yōu)勢菌群的形成，從而促進(jìn)竹種生長，此研究結(jié)果為今后研制竹種專用生物肥料提供理論基礎(chǔ)。