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        熒光染色法檢測γ-環(huán)糊精DNA殘留量方法驗證研究

        2020-11-10 09:15:24陳凌王永智雷高新邱文娜喬正鮑麗董達文
        中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2020年5期
        關(guān)鍵詞:染色法環(huán)糊精殘留量

        陳凌,王永智,雷高新,邱文娜,喬正,鮑麗,董達文

        作者單位:225300 江蘇,泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心(陳凌、王永智、雷高新、邱文娜、喬正、鮑麗);225300 泰州,揚子江藥業(yè)集團有限公司(董達文)

        γ-環(huán)糊精(γ-cyclodextrin,γ-CD)是環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶作用于淀粉、糖原、麥芽、寡聚糖等葡萄糖聚合物后形成的,由 8 個 D-吡喃葡萄糖基以 α-1,4-糖苷鍵首尾連接成的環(huán)形低聚糖[1]。由于極性羥基基團存在,環(huán)糊精具有內(nèi)疏水外親水的特性,可通過氫鍵、疏水作用等分子間作用力與多種有機化合物形成包合物,以此增加包合物的穩(wěn)定性,改變包合物的溶解度、釋放速度、氣味等理化性質(zhì),因此 γ-環(huán)糊精廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域[2-4]。但是 γ-環(huán)糊精生產(chǎn)過程中環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶主要從軟腐芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌等微生物中獲得,其生物安全性備受關(guān)注,特別是外源 DNA 殘留量的檢測尤為重要[5]。

        《中國藥典》三部(2015 版)《外源性 DNA 殘留量測定法》收錄的 DNA 殘留量測定方法有 DNA 探針雜交法和熒光染色法[6]。熒光染色法是應(yīng)用雙鏈 DNA 熒光染料與雙鏈 DNA 特異性結(jié)合形成復(fù)合物,在波長 480 nm 激發(fā)下產(chǎn)生熒光信號,可用熒光酶標儀在波長 520 nm 左右進行檢測,在一定的 DNA 濃度范圍內(nèi)以及在該熒光染料過量的情況下,熒光強度與 DNA 濃度成正比,根據(jù)檢測樣品的熒光強度,對 DNA 進行定量測定。該方法比起 DNA 探針雜交法,操作簡單、干擾因素少、周期短,并且能定 量分析[7-8]。所以本實驗應(yīng)用熒光染料 PicoGreen 試劑,對 γ-環(huán)糊精 DNA 殘留量進行檢測并進行方法驗證的研究。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        γ-環(huán)糊精由江蘇某制藥公司提供,批號:20171005;Quant-iT? PicoGreen?dsDNA Assay Kit、含 DNA 標準品(100 μg/ml)、雙鏈 DNA 熒光染料、20 × TE buffer 均購自美國 Life Technologies 公司;多功能酶標儀 Thermo Varioskan Lux 由美國 Thermo 公司生產(chǎn);96 孔黑色酶標板由美國 Corning 公司生產(chǎn);Denver Instrument TP-202 型電子天平由美國丹佛儀器公司生產(chǎn);移液器由德國 Eppendorf 公司生產(chǎn)。

        1.2 方法

        1.2.1 樣品配制 無菌注射用水稀釋 20 × TE buffer(1:20),γ-環(huán)糊精適量,用稀釋后的 1 × TE buffer 溶解配成 200 mg/ml 的樣品溶液。

        1.2.2 標準曲線建立 DNA 標準品用 1 × TE 緩沖液配成 125、25、5、1、0.2、0.04、0 μg/ml 系列濃度 DNA 標 準溶液。取 100 μl DNA 標準溶液加入 96 孔酶標板,加入等體積 PicoGreen 染料試劑混勻,室溫靜置 5 min,用熒光酶標儀在激發(fā)波長 480 nm、發(fā)射波長 520 nm 處測得熒光強度。以 DNA 標準品溶液的濃度(ng/ml)對其相應(yīng)的熒光強度(A)繪制標準曲線,求得回歸方程。

        1.2.3 專屬性 本實驗所用 DNA 熒光染料對 dsDNA 具有較強的特異性,故本實驗中對 γ-環(huán)糊精溶液的溶劑 1 × TE 緩沖液進行了考察,按照 1.2.2 方法檢測 DNA 濃度。

        1.2.4 準確度 γ-環(huán)糊精樣品加入 DNA 標準品,制成含 DNA 標準品終濃度分別為 100、50、10 ng/ml 的γ-環(huán)糊精溶液。其中,γ-環(huán)糊精溶液的終濃度為 200 mg/ml。精密吸取上述溶液各 100 μl 加入 96 孔酶標板(n = 3),各孔加入熒光染料溶液 100 μl,按 1.2.2 方法測得的溶液 DNA 濃度(ng/ml),計算回收率和相對標準偏差。

        回收率(%)=(實測加標樣品濃度-樣品濃度)/加入對照品濃度 × 100%

        1.2.5 重復(fù)性 精密吸取濃度為 50 ng/ml 的 DNA 標準品溶液 100 μl 至 96 孔黑色酶標板(n = 6),分別加入 dsDNA 熒光染料溶液 100 μl,混勻制得終濃度為 25 ng/ml的重復(fù)性測定用溶液,按照 1.2.2 方法測得的溶液 DNA 濃度,計算 RSD,考察方法的重復(fù)性。

        1.2.6 耐用性 考察溶解時間對樣品 DNA 殘留量的影響,稱取 γ-環(huán)糊精樣品 200 mg,以 1 × TE 緩沖液進行溶解配成 200 mg/ml 的樣品溶液,37 ℃ 分別放置 0、1、2、3、4、5 h 后按照 1.2.2 方法測得的溶液 DNA 濃度,計算測定結(jié)果 RSD,考察樣品溶液的穩(wěn)定性。

        2 結(jié)果

        2.1 線性和靈敏度

        圖1 DNA 標準曲線

        復(fù)孔檢測結(jié)果顯示,當 DNA 濃度為 0.04 ng/ml 時,其熒光強度與空白溶劑基本相當;而當 DNA 濃度為 0.2 ng/ml 時,熒光強度較高,能明顯檢出,因此該法的最 低檢出限定為 0.2 ng/ml,根據(jù)繪制得到標準曲線線性方 程 y = 0.1792x + 0.1252,R2= 0.9999,表明該法在 0.2 ~ 125 ng/ml 范圍內(nèi)線性較好(圖 1)。

        2.2 專屬性

        DNA 熒光染料 PicoGreen 對 dsDNA 具有較強的特異性,所以本實驗中對 γ-環(huán)糊精溶液的溶劑 1 × TE 緩沖液進行了考察,按照 1.2.2 方法對其檢測 DNA 濃度,計算得到 TE 溶劑平均濃度為 0.005 ng/ml(n = 6),SD 為 2.38%,表明溶劑對該法測定無干擾。

        2.3 準確度

        γ-環(huán)糊精高、中、低 3 種不同 DNA 加標濃度樣品 回收率在 90% ~ 110% 范圍內(nèi)(表 1),表明該法準確性 良好。

        2.4 重復(fù)性

        6 個重復(fù)樣品檢測值之間的 RSD 為 2.32%,小于 10%(表 2),表明該方法重復(fù)性良好。

        2.5 耐用性

        不同處理時間,樣品 DNA 殘留濃度分別為 3.05、2.98、3.25、2.75、2.84、3.05 ng/ml,RSD 為 5.95%,樣品具有良好的穩(wěn)定性(表 3)。

        3 討論

        關(guān)于外源性 DNA 殘留量檢測,各國藥典收錄的附錄方法不盡相同,《中國藥典》收錄了雜交法和熒光染色法,《美國藥典》收錄了定量 PCR 法,而《歐洲藥典》僅收錄了 DNA 雜交法[9]。雜交法利用固定在膜上的變性宿主細胞 DNA 與標記酶、生物素、放射性同位素或地高辛等標記的 DNA 序列進行雜交[10],其靈敏度很高,可達到 10 pg 左右,但雜交法操作費時費力,無法進行定量分析[11]。熒光定量 PCR 法(簡稱 qPCR)是近年來最受關(guān)注的 DNA 檢測方法,其原理是在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR 進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[9]。qPCR 所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種:熒光探針和熒光染料,其中熒光探針法檢測下限可達到 10 fg[12]。作為 DNA 檢測的最新技術(shù),qPCR 法操作相對簡單、特異性高、靈敏度很高,相信在不久的將來會得到更廣泛的應(yīng)用。

        本研究采用的熒光染色法,應(yīng)用熒光染料與雙鏈 DNA 特異性結(jié)合形成復(fù)合物,根據(jù)檢測樣品的熒光強度,對 DNA 進行定量測定。此方法與 qPCR 相比,存在特異性差,靈敏度低的不足,但是本實驗通過驗證,該方法線性、特異性、準確度、耐用性和重復(fù)性都很好,可以快速、精準地定量 γ-環(huán)糊精中殘留 DNA 含量。

        表1 γ-環(huán)糊精樣品加標回收率

        表2 方法的重復(fù)性試驗結(jié)果

        表3 樣品溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果

        另外值得注意的是,雖然熒光染色法操作更簡單、周期短、成本低、效益更高,但在實際的使用過程中熒光染色法容易受鹽類物質(zhì)如氯化鈉、醋酸鈉以及蛋白類物質(zhì)如白蛋白、IgG 的影響,所以不適用大劑量蛋白樣品的檢測,一般適宜用于含小劑量蛋白(如疫苗)或幾乎不含蛋白(如 γ-環(huán)糊精)制品 DNA 含量的快速檢測。

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