張雪,劉清,阿爾孜古麗·吐爾遜
作者單位:830054 烏魯木齊,新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院
流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù),結(jié)合了單克隆抗體技術(shù)、定量細(xì) 胞化學(xué)技術(shù)和定量熒光細(xì)胞化學(xué),可對(duì)特定細(xì)胞及顆粒進(jìn)行定性及定量分析,因操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、結(jié)果可靠,已 在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科中得到廣泛的應(yīng)用[1]。流式細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和分析的前提,是必須以單細(xì)胞為基礎(chǔ),因此制備出合格的單細(xì)胞懸液對(duì)流式分析的成敗至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)利用流式檢測(cè)所用不同抗體,考察單細(xì)胞懸液的三組 不同處理方法對(duì)流式檢測(cè)結(jié)果的影響,探討三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)[2]。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年昆明白小鼠 15 只,雄性,體質(zhì)量 20 g,由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供;合格證號(hào):SYXK(新)2018-003;飼養(yǎng)環(huán)境:SPF。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 AriaII 流式細(xì)胞儀購自美國(guó) BD 公司;DK8D 恒溫水浴鍋購自上海精宏公司;5424R 臺(tái)式離心機(jī)購自德國(guó) Eppendorf 公司;YS100 普通光學(xué)顯微鏡購自日本尼康公司。
1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 0.1% 膠原酶、PBS 均購自上海生工生物工程有限公司;紅細(xì)胞裂解液、CD45-FITC 和 CD3-PE 抗體均購自美國(guó) BD 公司。
1.2.1 脾組織標(biāo)本取材 將小鼠處死,每組 5 只,開腹取出脾臟并分為酶消化法(A 組)、機(jī)械法(B 組)、化學(xué)處理法(C 組)3 組,分別用不同的方法制備脾細(xì)胞懸液,并且用 7AAD 抗體標(biāo)記死細(xì)胞,判斷細(xì)胞活性。
1.2.2 脾單細(xì)胞懸液制備 將 A 組脾組織剪碎,放入 1.5 ml 離心管中,加入 1 ml 配置好的膠原酶稀釋液,將離心管置入 37 ℃ 的恒溫水浴鍋中振蕩消化 20 ~ 30 min,期間每隔 5 分鐘用吸管將管中的細(xì)胞輕柔吹打均勻并觀察消化情況,將消化后的細(xì)胞懸液通過 300 目過濾器移入離心管中;將 B 組脾臟用眼科剪剪碎,加入 15 ml PBS,并用研磨器研至勻漿,移入離心管中,1200 r/min 離心 5 min,再用 PBS 洗 3 次,經(jīng)濾器(300 目)過濾至離心管中;將 C 組離心管中加入 5 ml 0.2% EDTA 液,將鑷子撕開的脾組織放入,消化 30 min(室溫),離心棄上清,繼續(xù)加入配置好的胰酶-EDTA 液 5 ml,37 ℃ 的恒溫水浴鍋振蕩 30 min,經(jīng) 300 目濾網(wǎng)過濾,1000 r/min 離心 5 min,如此反復(fù)沖洗 2 ~ 3 次,計(jì)數(shù),調(diào)整三組單樣本細(xì)胞濃度 1 × 106個(gè)/ml。
1.2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定脾單細(xì)胞懸液白細(xì)胞 CD45、T 淋巴細(xì)胞 CD3 及死細(xì)胞 7AAD 表達(dá)量 取 3 個(gè)流式檢測(cè)管,分別取 A、B、C 三組單細(xì)胞懸液 100 μl 加入流式檢測(cè)管,不加抗體只做裂紅處理,設(shè)為空白對(duì)照組;其余每組設(shè)立 5 個(gè)復(fù)孔,每個(gè)試管分別加入 5 μl CD3-PE 及 CD45-FITC 抗體混勻,室溫避光反應(yīng) 20 ~ 30 min;各管中加入 1:100 稀釋的裂解液 2 ml 裂紅 5 min;PBS 沖洗,1000 r/min 離心 5 min,棄上清,每個(gè)樣本上機(jī)前分別加入 5 μl 7AAD,再加入 0.5 ml PBS 重懸,上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以± s表示,三組間比較采用多因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為 0.05,以 P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
本實(shí)驗(yàn)對(duì)雄性昆明白小鼠脾臟組織進(jìn)行取材,采用不同處理方法制備成為單細(xì)胞懸液,進(jìn)行抗體標(biāo)記,其中白細(xì)胞表達(dá) CD45,T 淋巴細(xì)胞表達(dá) CD3,死細(xì)胞表達(dá) 7AAD;經(jīng)流式檢測(cè)后得出(表 1):A 組酶消化法制備的單細(xì)胞懸液,細(xì)胞團(tuán)塊較少,細(xì)胞存活率較好,為(81.4 ± 3.1)%,淋巴細(xì)胞中 CD3 抗體表達(dá)率為(37.2 ± 1.9)%,白細(xì)胞 CD45 抗體表達(dá)率為(89.3 ± 1.6)%;B 組機(jī)械研磨法制 備的單細(xì)胞懸液,細(xì)胞團(tuán)塊較多,細(xì)胞存活率僅為(57.9 ± 2.8)%,淋巴細(xì)胞中 CD3 抗體表達(dá)率為(35.6 ± 2.2)%,白細(xì)胞 CD45 抗體表達(dá)率為(60.3 ± 2.1)%;C 組化學(xué)處理法制備的單細(xì)胞懸液,細(xì)胞團(tuán)塊較少,細(xì)胞存活率低為(66.2 ± 1.9)%,淋巴細(xì)胞中 CD3 抗體表達(dá)率為(36.1 ± 2.2)%,白細(xì)胞 CD45 抗體表達(dá)率為(55.1 ± 2.9)%; 三組在應(yīng)用不同方法制備所得的組織單細(xì)胞懸液在細(xì)胞得率、細(xì)胞存活率上及白細(xì)胞 CD45 抗體表達(dá)率存在不同 程度的差異(P < 0.05),見表 1、圖 1、圖 2;三組在淋巴細(xì)胞中 CD3 抗體表達(dá)上無明顯差異(P > 0.05),見表 1、圖 3。
表1 不同方法制備小鼠脾臟組織單細(xì)胞懸液的流式結(jié)果比較
圖1 A、B、C 三種不同處理方法 CD45 表達(dá)
圖2 A、B、C 三種不同處理方法的細(xì)胞存活率(7AAD 陰性表達(dá))
圖3 A、B、C 三組不同處理方法 CD3 表達(dá)
流式細(xì)胞技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便快速、節(jié)省樣本和結(jié)果可靠,已在免疫學(xué)、細(xì)胞分子生物學(xué)等研究中得到廣泛的應(yīng) 用[3]。流式細(xì)胞技術(shù)是通過檢測(cè)細(xì)胞及微粒,分析單個(gè)細(xì)胞及微粒的不同特性,其必須基于單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行參數(shù)分析,因此制備出合格的單細(xì)胞懸液對(duì)流式分析的成敗至關(guān)重要。為了達(dá)到細(xì)胞產(chǎn)量高、損傷小的目的,必須選擇合適的細(xì)胞分散方法[4]。
本研究以小鼠脾臟為標(biāo)本,選用機(jī)械研磨法、酶消化法及化學(xué)處理法分別制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式檢測(cè)可知:三組方法均能獲得單細(xì)胞懸液,但細(xì)胞碎片和團(tuán)塊、細(xì)胞存活率及抗體表達(dá)率均有所差異。由此可以得到結(jié)論:在一定處理時(shí)間內(nèi),如果需要獲得單細(xì)胞產(chǎn)率高,樣本細(xì)胞數(shù)要求較多的實(shí)驗(yàn),可以采 用酶消化法;而預(yù)得到無粘連的、懸浮狀態(tài)良好的單細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞得率要求不高,則可以采用化學(xué)處理法處理;單純機(jī)械研磨法細(xì)胞碎片和組織碎片及細(xì)胞團(tuán)塊較多,細(xì)胞得率及細(xì)胞存活率均較低,但勝在易于操作,速度更快。本研究結(jié)果與以往的研究不同的是,通過不同處理方法,所得到淋巴細(xì)胞比率與白細(xì)胞比率的差異性并不同步,三種方法 CD3 所占淋巴細(xì)胞百分比無明顯差異,而白細(xì)胞所占比率有顯著性差異,這就為脾臟組織的單細(xì)胞懸液制備及流式測(cè)定提供了方法學(xué)參考。就免疫細(xì)胞檢測(cè)而言,酶消化法可以獲得更理想的單細(xì)胞懸液及檢測(cè)數(shù)據(jù),但由于實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備目前尚缺乏通用的方法,不同組織所適用的方法也不盡相同,甚至同一組織由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌梅椒ㄒ膊槐M相同,所以如何選擇合適的單細(xì)胞懸液制備方法以獲得所期望的樣本和更好的流式檢測(cè)結(jié)果,有待通過多種方法的不同組合并結(jié)合形態(tài)學(xué)的評(píng)價(jià)才更為準(zhǔn)確[5]。