張雪，劉清，阿爾孜古麗·吐爾遜

作者單位：830054 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院

流式細胞檢測技術(shù)，結(jié)合了單克隆抗體技術(shù)、定量細 胞化學(xué)技術(shù)和定量熒光細胞化學(xué)，可對特定細胞及顆粒進行定性及定量分析，因操作簡便、重復(fù)性好、結(jié)果可靠，已 在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科中得到廣泛的應(yīng)用[1]。流式細胞進行檢測和分析的前提，是必須以單細胞為基礎(chǔ)，因此制備出合格的單細胞懸液對流式分析的成敗至關(guān)重要。本實驗利用流式檢測所用不同抗體，考察單細胞懸液的三組 不同處理方法對流式檢測結(jié)果的影響，探討三種方法的優(yōu)缺點[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年昆明白小鼠 15 只，雄性，體質(zhì)量 20 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供；合格證號：SYXK（新）2018-003；飼養(yǎng)環(huán)境：SPF。

1.1.2 實驗儀器 AriaII 流式細胞儀購自美國 BD 公司；DK8D 恒溫水浴鍋購自上海精宏公司；5424R 臺式離心機購自德國 Eppendorf 公司；YS100 普通光學(xué)顯微鏡購自日本尼康公司。

1.1.3 實驗試劑 0.1% 膠原酶、PBS 均購自上海生工生物工程有限公司；紅細胞裂解液、CD45-FITC 和 CD3-PE 抗體均購自美國 BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 脾組織標(biāo)本取材 將小鼠處死，每組 5 只，開腹取出脾臟并分為酶消化法（A 組）、機械法（B 組）、化學(xué)處理法（C 組）3 組，分別用不同的方法制備脾細胞懸液，并且用 7AAD 抗體標(biāo)記死細胞，判斷細胞活性。

1.2.2 脾單細胞懸液制備 將 A 組脾組織剪碎，放入 1.5 ml 離心管中，加入 1 ml 配置好的膠原酶稀釋液，將離心管置入 37 ℃ 的恒溫水浴鍋中振蕩消化 20 ～ 30 min，期間每隔 5 分鐘用吸管將管中的細胞輕柔吹打均勻并觀察消化情況，將消化后的細胞懸液通過 300 目過濾器移入離心管中；將 B 組脾臟用眼科剪剪碎，加入 15 ml PBS，并用研磨器研至勻漿，移入離心管中，1200 r/min 離心 5 min，再用 PBS 洗 3 次，經(jīng)濾器（300 目）過濾至離心管中；將 C 組離心管中加入 5 ml 0.2% EDTA 液，將鑷子撕開的脾組織放入，消化 30 min（室溫），離心棄上清，繼續(xù)加入配置好的胰酶-EDTA 液 5 ml，37 ℃ 的恒溫水浴鍋振蕩 30 min，經(jīng) 300 目濾網(wǎng)過濾，1000 r/min 離心 5 min，如此反復(fù)沖洗 2 ～ 3 次，計數(shù)，調(diào)整三組單樣本細胞濃度 1 × 106個/ml。

1.2.3 流式細胞儀測定脾單細胞懸液白細胞 CD45、T 淋巴細胞 CD3 及死細胞 7AAD 表達量 取 3 個流式檢測管，分別取 A、B、C 三組單細胞懸液 100 μl 加入流式檢測管，不加抗體只做裂紅處理，設(shè)為空白對照組；其余每組設(shè)立 5 個復(fù)孔，每個試管分別加入 5 μl CD3-PE 及 CD45-FITC 抗體混勻，室溫避光反應(yīng) 20 ～ 30 min；各管中加入 1:100 稀釋的裂解液 2 ml 裂紅 5 min；PBS 沖洗，1000 r/min 離心 5 min，棄上清，每個樣本上機前分別加入 5 μl 7AAD，再加入 0.5 ml PBS 重懸，上機進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以± s表示，三組間比較采用多因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)為 0.05，以 P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

本實驗對雄性昆明白小鼠脾臟組織進行取材，采用不同處理方法制備成為單細胞懸液，進行抗體標(biāo)記，其中白細胞表達 CD45，T 淋巴細胞表達 CD3，死細胞表達 7AAD；經(jīng)流式檢測后得出（表 1）：A 組酶消化法制備的單細胞懸液，細胞團塊較少，細胞存活率較好，為（81.4 ± 3.1）%，淋巴細胞中 CD3 抗體表達率為（37.2 ± 1.9）%，白細胞 CD45 抗體表達率為（89.3 ± 1.6）%；B 組機械研磨法制 備的單細胞懸液，細胞團塊較多，細胞存活率僅為（57.9 ± 2.8）%，淋巴細胞中 CD3 抗體表達率為（35.6 ± 2.2）%，白細胞 CD45 抗體表達率為（60.3 ± 2.1）%；C 組化學(xué)處理法制備的單細胞懸液，細胞團塊較少，細胞存活率低為（66.2 ± 1.9）%，淋巴細胞中 CD3 抗體表達率為（36.1 ± 2.2）%，白細胞 CD45 抗體表達率為（55.1 ± 2.9）%； 三組在應(yīng)用不同方法制備所得的組織單細胞懸液在細胞得率、細胞存活率上及白細胞 CD45 抗體表達率存在不同 程度的差異（P ＜ 0.05），見表 1、圖 1、圖 2；三組在淋巴細胞中 CD3 抗體表達上無明顯差異（P ＞ 0.05），見表 1、圖 3。

表1 不同方法制備小鼠脾臟組織單細胞懸液的流式結(jié)果比較

圖1 A、B、C 三種不同處理方法 CD45 表達

圖2 A、B、C 三種不同處理方法的細胞存活率（7AAD 陰性表達）

圖3 A、B、C 三組不同處理方法 CD3 表達

3 討論

流式細胞技術(shù)由于操作簡便快速、節(jié)省樣本和結(jié)果可靠，已在免疫學(xué)、細胞分子生物學(xué)等研究中得到廣泛的應(yīng) 用[3]。流式細胞技術(shù)是通過檢測細胞及微粒，分析單個細胞及微粒的不同特性，其必須基于單個細胞進行參數(shù)分析，因此制備出合格的單細胞懸液對流式分析的成敗至關(guān)重要。為了達到細胞產(chǎn)量高、損傷小的目的，必須選擇合適的細胞分散方法[4]。

本研究以小鼠脾臟為標(biāo)本，選用機械研磨法、酶消化法及化學(xué)處理法分別制備單細胞懸液進行實驗，通過對細胞形態(tài)學(xué)觀察、細胞計數(shù)和流式檢測可知：三組方法均能獲得單細胞懸液，但細胞碎片和團塊、細胞存活率及抗體表達率均有所差異。由此可以得到結(jié)論：在一定處理時間內(nèi)，如果需要獲得單細胞產(chǎn)率高，樣本細胞數(shù)要求較多的實驗，可以采 用酶消化法；而預(yù)得到無粘連的、懸浮狀態(tài)良好的單細胞，對細胞得率要求不高，則可以采用化學(xué)處理法處理；單純機械研磨法細胞碎片和組織碎片及細胞團塊較多，細胞得率及細胞存活率均較低，但勝在易于操作，速度更快。本研究結(jié)果與以往的研究不同的是，通過不同處理方法，所得到淋巴細胞比率與白細胞比率的差異性并不同步，三種方法 CD3 所占淋巴細胞百分比無明顯差異，而白細胞所占比率有顯著性差異，這就為脾臟組織的單細胞懸液制備及流式測定提供了方法學(xué)參考。就免疫細胞檢測而言，酶消化法可以獲得更理想的單細胞懸液及檢測數(shù)據(jù)，但由于實體組織單細胞懸液的制備目前尚缺乏通用的方法，不同組織所適用的方法也不盡相同，甚至同一組織由于實驗?zāi)康牡牟煌梅椒ㄒ膊槐M相同，所以如何選擇合適的單細胞懸液制備方法以獲得所期望的樣本和更好的流式檢測結(jié)果，有待通過多種方法的不同組合并結(jié)合形態(tài)學(xué)的評價才更為準(zhǔn)確[5]。