張雪，劉清，阿爾孜古麗·吐爾遜

作者單位：830054 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院

流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合了單克隆抗體技術(shù)、定量細(xì) 胞化學(xué)技術(shù)和定量熒光細(xì)胞化學(xué)，可對(duì)特定細(xì)胞及顆粒進(jìn)行定性及定量分析，因操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、結(jié)果可靠，已 在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科中得到廣泛的應(yīng)用[1]。流式細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和分析的前提，是必須以單細(xì)胞為基礎(chǔ)，因此制備出合格的單細(xì)胞懸液對(duì)流式分析的成敗至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)利用流式檢測(cè)所用不同抗體，考察單細(xì)胞懸液的三組 不同處理方法對(duì)流式檢測(cè)結(jié)果的影響，探討三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年昆明白小鼠 15 只，雄性，體質(zhì)量 20 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供；合格證號(hào)：SYXK（新）2018-003；飼養(yǎng)環(huán)境：SPF。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 AriaII 流式細(xì)胞儀購自美國(guó) BD 公司；DK8D 恒溫水浴鍋購自上海精宏公司；5424R 臺(tái)式離心機(jī)購自德國(guó) Eppendorf 公司；YS100 普通光學(xué)顯微鏡購自日本尼康公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 0.1% 膠原酶、PBS 均購自上海生工生物工程有限公司；紅細(xì)胞裂解液、CD45-FITC 和 CD3-PE 抗體均購自美國(guó) BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 脾組織標(biāo)本取材 將小鼠處死，每組 5 只，開腹取出脾臟并分為酶消化法（A 組）、機(jī)械法（B 組）、化學(xué)處理法（C 組）3 組，分別用不同的方法制備脾細(xì)胞懸液，并且用 7AAD 抗體標(biāo)記死細(xì)胞，判斷細(xì)胞活性。

1.2.2 脾單細(xì)胞懸液制備 將 A 組脾組織剪碎，放入 1.5 ml 離心管中，加入 1 ml 配置好的膠原酶稀釋液，將離心管置入 37 ℃ 的恒溫水浴鍋中振蕩消化 20 ～ 30 min，期間每隔 5 分鐘用吸管將管中的細(xì)胞輕柔吹打均勻并觀察消化情況，將消化后的細(xì)胞懸液通過 300 目過濾器移入離心管中；將 B 組脾臟用眼科剪剪碎，加入 15 ml PBS，并用研磨器研至勻漿，移入離心管中，1200 r/min 離心 5 min，再用 PBS 洗 3 次，經(jīng)濾器（300 目）過濾至離心管中；將 C 組離心管中加入 5 ml 0.2% EDTA 液，將鑷子撕開的脾組織放入，消化 30 min（室溫），離心棄上清，繼續(xù)加入配置好的胰酶-EDTA 液 5 ml，37 ℃ 的恒溫水浴鍋振蕩 30 min，經(jīng) 300 目濾網(wǎng)過濾，1000 r/min 離心 5 min，如此反復(fù)沖洗 2 ～ 3 次，計(jì)數(shù)，調(diào)整三組單樣本細(xì)胞濃度 1 × 106個(gè)/ml。

1.2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定脾單細(xì)胞懸液白細(xì)胞 CD45、T 淋巴細(xì)胞 CD3 及死細(xì)胞 7AAD 表達(dá)量 取 3 個(gè)流式檢測(cè)管，分別取 A、B、C 三組單細(xì)胞懸液 100 μl 加入流式檢測(cè)管，不加抗體只做裂紅處理，設(shè)為空白對(duì)照組；其余每組設(shè)立 5 個(gè)復(fù)孔，每個(gè)試管分別加入 5 μl CD3-PE 及 CD45-FITC 抗體混勻，室溫避光反應(yīng) 20 ～ 30 min；各管中加入 1:100 稀釋的裂解液 2 ml 裂紅 5 min；PBS 沖洗，1000 r/min 離心 5 min，棄上清，每個(gè)樣本上機(jī)前分別加入 5 μl 7AAD，再加入 0.5 ml PBS 重懸，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以± s表示，三組間比較采用多因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為 0.05，以 P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)對(duì)雄性昆明白小鼠脾臟組織進(jìn)行取材，采用不同處理方法制備成為單細(xì)胞懸液，進(jìn)行抗體標(biāo)記，其中白細(xì)胞表達(dá) CD45，T 淋巴細(xì)胞表達(dá) CD3，死細(xì)胞表達(dá) 7AAD；經(jīng)流式檢測(cè)后得出（表 1）：A 組酶消化法制備的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞團(tuán)塊較少，細(xì)胞存活率較好，為（81.4 ± 3.1）%，淋巴細(xì)胞中 CD3 抗體表達(dá)率為（37.2 ± 1.9）%，白細(xì)胞 CD45 抗體表達(dá)率為（89.3 ± 1.6）%；B 組機(jī)械研磨法制 備的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞團(tuán)塊較多，細(xì)胞存活率僅為（57.9 ± 2.8）%，淋巴細(xì)胞中 CD3 抗體表達(dá)率為（35.6 ± 2.2）%，白細(xì)胞 CD45 抗體表達(dá)率為（60.3 ± 2.1）%；C 組化學(xué)處理法制備的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞團(tuán)塊較少，細(xì)胞存活率低為（66.2 ± 1.9）%，淋巴細(xì)胞中 CD3 抗體表達(dá)率為（36.1 ± 2.2）%，白細(xì)胞 CD45 抗體表達(dá)率為（55.1 ± 2.9）%； 三組在應(yīng)用不同方法制備所得的組織單細(xì)胞懸液在細(xì)胞得率、細(xì)胞存活率上及白細(xì)胞 CD45 抗體表達(dá)率存在不同 程度的差異（P ＜ 0.05），見表 1、圖 1、圖 2；三組在淋巴細(xì)胞中 CD3 抗體表達(dá)上無明顯差異（P ＞ 0.05），見表 1、圖 3。

表1 不同方法制備小鼠脾臟組織單細(xì)胞懸液的流式結(jié)果比較

圖1 A、B、C 三種不同處理方法 CD45 表達(dá)

圖2 A、B、C 三種不同處理方法的細(xì)胞存活率（7AAD 陰性表達(dá)）

圖3 A、B、C 三組不同處理方法 CD3 表達(dá)

3 討論

流式細(xì)胞技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便快速、節(jié)省樣本和結(jié)果可靠，已在免疫學(xué)、細(xì)胞分子生物學(xué)等研究中得到廣泛的應(yīng) 用[3]。流式細(xì)胞技術(shù)是通過檢測(cè)細(xì)胞及微粒，分析單個(gè)細(xì)胞及微粒的不同特性，其必須基于單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行參數(shù)分析，因此制備出合格的單細(xì)胞懸液對(duì)流式分析的成敗至關(guān)重要。為了達(dá)到細(xì)胞產(chǎn)量高、損傷小的目的，必須選擇合適的細(xì)胞分散方法[4]。

本研究以小鼠脾臟為標(biāo)本，選用機(jī)械研磨法、酶消化法及化學(xué)處理法分別制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式檢測(cè)可知：三組方法均能獲得單細(xì)胞懸液，但細(xì)胞碎片和團(tuán)塊、細(xì)胞存活率及抗體表達(dá)率均有所差異。由此可以得到結(jié)論：在一定處理時(shí)間內(nèi)，如果需要獲得單細(xì)胞產(chǎn)率高，樣本細(xì)胞數(shù)要求較多的實(shí)驗(yàn)，可以采 用酶消化法；而預(yù)得到無粘連的、懸浮狀態(tài)良好的單細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞得率要求不高，則可以采用化學(xué)處理法處理；單純機(jī)械研磨法細(xì)胞碎片和組織碎片及細(xì)胞團(tuán)塊較多，細(xì)胞得率及細(xì)胞存活率均較低，但勝在易于操作，速度更快。本研究結(jié)果與以往的研究不同的是，通過不同處理方法，所得到淋巴細(xì)胞比率與白細(xì)胞比率的差異性并不同步，三種方法 CD3 所占淋巴細(xì)胞百分比無明顯差異，而白細(xì)胞所占比率有顯著性差異，這就為脾臟組織的單細(xì)胞懸液制備及流式測(cè)定提供了方法學(xué)參考。就免疫細(xì)胞檢測(cè)而言，酶消化法可以獲得更理想的單細(xì)胞懸液及檢測(cè)數(shù)據(jù)，但由于實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備目前尚缺乏通用的方法，不同組織所適用的方法也不盡相同，甚至同一組織由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌梅椒ㄒ膊槐M相同，所以如何選擇合適的單細(xì)胞懸液制備方法以獲得所期望的樣本和更好的流式檢測(cè)結(jié)果，有待通過多種方法的不同組合并結(jié)合形態(tài)學(xué)的評(píng)價(jià)才更為準(zhǔn)確[5]。