但 丁，孫春平，陳浩宇,2，梁 路,2，徐 佳,2，張常娥,2**

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)蛋白質(zhì)修飾與降解實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511436；2.廣州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室)

腦血管疾病已成為首要危害人類生命與健康的常見病和多發(fā)病之一，其中最常見的是腦卒中，分為缺血性(腦梗死)和出血性(腦出血)腦卒中兩種類型，前者在臨床病例中約占70%以上。研究表明，腦卒中誘因復(fù)雜且多樣，多為可防控的后天性因素，如高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙、肥胖等[1]。隨著臨床溶栓療法的應(yīng)用開展，發(fā)現(xiàn)因氧反常、pH反常、鈣反常等因素[2]，血流再灌注有時(shí)會(huì)加劇腦組織損傷。但恢復(fù)血流灌注是防止缺血腦組織進(jìn)一步損傷的主要措施[3]，如何減輕這種矛盾性的問(wèn)題，目前仍是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

L-卡尼汀(L-carnitine，LC)[4]是機(jī)體內(nèi)源性小分子，輔助線粒體內(nèi)膜肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶，參與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)β-氧化過(guò)程產(chǎn)生ATP，提供生命活動(dòng)所需能量。研究表明LC有預(yù)防心肌缺血性損傷的作用。本課題組曾采用Zea-Longa[5]改良線栓法構(gòu)建大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型，對(duì)比研究了LC對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注的預(yù)防和治療作用，發(fā)現(xiàn)LC對(duì)腦缺血再灌注性損傷有預(yù)防作用優(yōu)于治療效果。本實(shí)驗(yàn)在前期的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究LC對(duì)腦缺血再灌注性損傷的預(yù)防機(jī)制，為闡明腦缺血再灌注損傷的預(yù)防或治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為相關(guān)藥物開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器及型號(hào)

Denver instrument電子天平，Eppendorf 5810R型離心機(jī)，Leica 2000振蕩切片機(jī)，Olympus BX51型顯微鏡，尼康照相機(jī)，F(xiàn)LOKO勻漿器，Thermo全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，Bio-Rad電泳-轉(zhuǎn)膜儀。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

3月齡SPF級(jí)成年雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量(260±20)g。由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：44007200000384/440720929。隨機(jī)分成3組，每組24只，即假手術(shù)組(Sham組)、腦缺血再灌注組(I/R組)和L-卡尼汀預(yù)防組(LC組)。所有大鼠在廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心正常飼養(yǎng)，室溫(24±1)℃，濕度正常，保持12h光照/12h黑暗的光照規(guī)律。

1.1.3 藥品與主要試劑

LC購(gòu)自Sigma公司，DAB顯色液購(gòu)自南京建成生物工程研究所，大鼠白細(xì)胞介素IL-1β及腫瘤壞死因子TNF-α的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司，Bax和Bcl-2等抗體購(gòu)自CST公司。其它試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)化學(xué)分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦缺血再灌注(I/R)損傷模型的復(fù)制

根據(jù)Zea-Longa法進(jìn)行改良，利用線栓復(fù)制大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型。具體手術(shù)操作方法及實(shí)驗(yàn)要求參照文獻(xiàn)[6]。

1.2.2 LC藥物的注射[6]

LC采用生理鹽水配置成20mg/mL濃度，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩ham組與I/R組，大鼠在I/R手術(shù)操作前2h和再灌注前2h腹腔注射生理鹽水；LC預(yù)防組大鼠在相同時(shí)間點(diǎn)注射LC，劑量為200mg/kg。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 腦梗死體積的測(cè)量

根據(jù)改良Longa線栓法進(jìn)行大鼠大腦中動(dòng)脈缺血2h再灌注24h后，對(duì)所有大鼠進(jìn)行進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，以確定腦缺血再灌注模型是否成功，具體結(jié)果參見本課題組前期報(bào)道的文獻(xiàn)[6]。每組隨機(jī)取6只大鼠進(jìn)行腦梗死體積的測(cè)量，具體操作和計(jì)算方法與文獻(xiàn)[6]一致。

1.3.2 血清及腦組織炎癥介質(zhì)測(cè)定

所有大鼠用10%水合氯醛麻醉后，開胸經(jīng)左心室取血，室溫靜置2h后，如果有溶血現(xiàn)象就不納入，4℃ 3000r/min離心10min，分離血清，-20℃儲(chǔ)存待測(cè)。大鼠取血后，斷頭取腦，冰生理鹽水漂洗，分離右側(cè)大腦皮質(zhì)，用生理鹽水制成10%腦組織勻漿，4℃，10000g離心10min，取上清液，-20℃凍存待測(cè)。ELISA法檢測(cè)血清及腦組織中的TNF-α和IL-1β含量，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.3 腦水腫含量測(cè)定

每組取6只大鼠斷頭后取出全腦，去掉嗅球腦干和小腦，沿正中矢狀線分開左右兩側(cè)腦半球，右側(cè)腦組織生理鹽水洗凈并濾紙吸干，稱腦組織濕重后，置于60℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，烘干2～3d，待腦組織恒重后稱其干重，計(jì)算腦組織含水量。含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.4 腦組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

每組取3只大鼠，4%多聚甲醛灌流固定后，取出全腦組織后固定24h。切取顳葉對(duì)應(yīng)全腦區(qū)域，進(jìn)行連續(xù)震蕩冠狀切片，厚度為20μm，置于含0.05% NaN3的0.1M PB緩沖液鹽溶液中，4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｃ恐淮笫笕?片切片，梯度酒精脫水，尼氏染色，常規(guī)透明、封片，光鏡下觀察組織病理改變并拍照分析。

1.3.5 免疫組化檢測(cè)

上述每只大鼠腦組織連續(xù)切片中，每隔5片取1片，每只共取5片，用ABC法進(jìn)行Bax和Bcl-2的免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色，后續(xù)拍照并進(jìn)行灰度OD值分析。

1.3.6 Western-Blot檢測(cè)

每組取3只大鼠取血后，斷頭取腦，冰生理鹽水漂洗，分離右側(cè)顳葉皮質(zhì)。用蛋白裂解液提取腦組織蛋白，蛋白勻漿提取液置于-20℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。BCA法測(cè)定組織蛋白含量，Western-Blot檢測(cè)腦組織Bax和Bcl-2的表達(dá)量，并進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死體積結(jié)果

大鼠經(jīng)過(guò)缺血2h再灌注24h后，每組取6只全腦進(jìn)行TTC染色。I/R組所有大鼠右側(cè)大腦皮層出現(xiàn)大面積梗死灶。通過(guò)Image J圖形處理軟件對(duì)梗死灶計(jì)算：假手術(shù)組無(wú)梗死，I/R組梗死灶體積百分比約為(34.50±4.32)%，兩組比較差異有非常顯著性(P<0.01)；用LC預(yù)防后，大鼠腦梗死體積顯著減少，平均為(11.13±3.13)%，與I/R組比較差異有非常顯著性(P<0.01)，見圖1(封二)。

2.2 大鼠血清及腦組織炎癥介質(zhì)變化

大鼠經(jīng)右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血2h再灌注24后，ELISA檢測(cè)血清和腦組織炎癥介質(zhì)IL-1β及TNF-α含量。結(jié)果顯示：I/R組血清和腦組織IL-1β及TNF-α含量上升，與Sham組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。LC預(yù)處理能顯著降低血清和腦組織炎癥介質(zhì)IL-1β及TNF-α含量，LC組與I/R組比較差異有顯著性(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清、腦組織炎癥介質(zhì)及腦含水量變化

2.3 大鼠腦組織含水量變化

缺血再灌注損傷引起腦組織含水量增加及水腫。大鼠經(jīng)過(guò)右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血2h再灌注24h后，取出腦組織，肉眼觀察可見I/R組大鼠右側(cè)腦組織因明顯的水腫導(dǎo)致體積增大，顳葉區(qū)出現(xiàn)缺血性灰白色變化；LC組大鼠經(jīng)過(guò)2次LC 200mg/kg注射后，腦組織水腫和顏色變化程度比I/R組大鼠明顯減輕。腦組織經(jīng)過(guò)60℃烘烤，分析和計(jì)算其濕重和干重之比，發(fā)現(xiàn)I/R組大鼠腦組織含水量顯著增加，與Sham組比較有顯著性差異(P<0.05)，經(jīng)LC預(yù)處理后，腦組織含水量顯著減少，與Sham組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，與I/R組比較差異具有顯著性(P<0.05)，見表1。

2.4 尼氏染色結(jié)果

每組選取3只大鼠，每只選取3片進(jìn)行尼氏染色。普通光鏡下，尼氏小體為紫色。右側(cè)顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元的尼氏結(jié)果顯示：Sham組尼氏小體染色均一，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，無(wú)壞死，細(xì)胞間隙致密無(wú)水腫。I/R組神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，排列紊亂，神經(jīng)元胞體變小，尼氏小體減少，胞質(zhì)染色變淺或濃縮，胞核出現(xiàn)固縮、碎裂或溶解等。LC組大部分神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，部分細(xì)胞存在腫脹，可見散在的壞死組織，細(xì)胞間輕微水腫。見圖2(封二)。

2.5 大鼠腦組織Bax和Bcl-2的變化

每只大鼠選取5片腦組織切片，用Bax和Bcl-2抗體進(jìn)行免疫組化染色，拍照進(jìn)行分析。Bax抗體的免疫組化結(jié)果顯示：Sham組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞排列密集整齊，細(xì)胞漿無(wú)棕色染色，細(xì)胞核居中，核仁清楚；I/R組大腦皮層顳葉部位神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)紊亂，排列不整齊，大部分神經(jīng)元可見深棕色染色，部分區(qū)域出現(xiàn)核固縮、碎裂、細(xì)胞溶解等壞死現(xiàn)象，間質(zhì)水腫嚴(yán)重，經(jīng)脫水后出現(xiàn)大量的空洞。LC組可見部分神經(jīng)元呈現(xiàn)淺棕色染色，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)排列較整齊，細(xì)胞核比較完整，可見少量神經(jīng)元損傷和壞死現(xiàn)象，間質(zhì)存在少量水腫。Bcl-2抗體的免疫組化染色結(jié)果與Bax相反，神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)排列和損傷則相類似。見圖3(封二)。

每組隨機(jī)選取3只大鼠右顳葉皮質(zhì)，用組織蛋白裂解液制成10%的腦組織勻漿，Western-blotting法檢測(cè)腦組織Bax和Bcl-2的變化。結(jié)果顯示：與Sham組比較，I/R組腦組織Bax表達(dá)量顯著增多，Bcl-2表達(dá)則顯著性減少，經(jīng)灰度分析兩組有顯著性差異(分別為P<0.01，P<0.05)；而用LC預(yù)防后，顯著性改變了上述Bax和Bcl-2在腦組織中的表達(dá)水平。見圖4。

A.Western-blotting法檢測(cè)腦組織Bax和Bcl-2結(jié)果；B.Western-blotting法檢測(cè)腦組織Bax和Bcl-2結(jié)果相對(duì)灰度值(與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與I/R組比較，△P<0.05；n=3)

3 討 論

在臨床腦血管病中，缺血性腦血管病具有高發(fā)病率、致殘率及死亡率的特點(diǎn)，是人類三大死亡原因之一[7]，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。腦缺血超過(guò)一定時(shí)限后發(fā)生缺血性損傷，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)腦梗死，恢復(fù)缺血腦組織的血流是防止腦梗死的必要措施。臨床研究指出，灌注液的流量、Na+/Ca2+比值、pH值及線粒體膜的穩(wěn)定性[8]等多種條件均能影響I/R所引起的損傷程度。因此，預(yù)防腦缺血后再灌注引起的后續(xù)損傷在腦卒中防治方面具有重要意義。

LC在機(jī)體內(nèi)主要提高組織器官脂肪酸代謝水平[4]。據(jù)報(bào)道[9]：LC能促進(jìn)心肌細(xì)胞能量代謝，降低Ca2+超載水平，對(duì)心肌缺血再灌注損傷有一定的預(yù)防和治療作用。LC在腎臟中也能促進(jìn)脂肪酸氧化供能過(guò)程[10]，但較少報(bào)道LC在腦組織中的作用。本課題組曾報(bào)道[6]，大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓法構(gòu)建腦缺血再灌注模型，缺血2h后拔出線栓，大腦中動(dòng)脈血流由大腦前動(dòng)脈供應(yīng)恢復(fù)再灌注，大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重皮質(zhì)神經(jīng)元損傷，右眼瞼肌張力下降，無(wú)法直線行走，出現(xiàn)咬尾或轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象；恢復(fù)血液灌注24h后，大鼠的行為表現(xiàn)持續(xù)存在。經(jīng)檢測(cè)血漿和腦組織各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：對(duì)比I/R組，LC組腦組織中ATP含量顯著升高，血漿和腦組織中SOD活力增加，MDA的含量下降。這些結(jié)果說(shuō)明LC預(yù)防性給藥后，大鼠腦組織能量代謝水平和抗氧化能力增強(qiáng)，這可能是LC預(yù)防大鼠腦I/R損傷的部分機(jī)制。

為了探討LC預(yù)防大鼠腦缺血再灌注性損傷是否存在其它機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在前期動(dòng)物模型和給藥方法的基礎(chǔ)上，做了進(jìn)一步研究。發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注24h后，I/R組大鼠腦組織炎癥反應(yīng)和含水量顯著增加，尼氏染色和免疫組化結(jié)果顯示：梗死灶的中央?yún)^(qū)域有大量的細(xì)胞壞死溶解，部分細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征， Western-blotting結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)腦組織促凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)增多，而抑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2減少。這些結(jié)果說(shuō)明了大鼠局灶性腦缺血后，腦組織缺血缺氧引起的組織損傷，并不能因?yàn)檠涸俟嘧⒍纳?，反而容易觸發(fā)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腦水腫，增加神經(jīng)元凋亡程度，表明再灌注加重大鼠腦組織的缺血性損傷。LC組通過(guò)腦缺血前2h和再灌注前2h分別腹腔注射200mg/kg的LC，相比于I/R組，腦組織的炎癥反應(yīng)和水腫輕度明顯減輕，尼氏染色和免疫組化結(jié)果均表明LC組腦間質(zhì)水腫及梗死區(qū)域減輕，凋亡神經(jīng)元減少，WB顯示促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平減少，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高。上述結(jié)果表明LC有抗炎、減輕腦組織水腫和抗凋亡作用，從而進(jìn)一步闡明了LC預(yù)防大鼠腦缺血再灌注性損傷的機(jī)制。

綜合本課題組的研究發(fā)現(xiàn)可以闡明：LC對(duì)腦缺血再灌注性損傷的預(yù)防機(jī)制可涉及到提高能量代謝、抗氧化、抗炎、抗水腫和抗凋亡等幾個(gè)方面。至于LC預(yù)防腦缺血再灌注損傷更深層的分子生物學(xué)機(jī)制，如代謝相關(guān)通路的激活以及其調(diào)控凋亡相關(guān)通路的方式，尚需要進(jìn)一步研究來(lái)闡明。本研究可以為臨床上LC預(yù)防腦缺血再灌注損傷提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為L(zhǎng)C是否可以作為腦缺血的治療藥物提供一定理論指導(dǎo)。