吉米麗汗·司馬依，買買提明·努爾買買提，艾尼瓦爾·吾買爾，努麗比亞·買合木提，買爾旦·玉蘇甫，木哈待斯·努爾，卡依賽爾·阿布都肉蘇力，周文婷*

1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；2新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011

2019年12月底我國武漢市爆發(fā)新型冠狀病毒肺炎疫情，由這一病毒導(dǎo)致的疾病的正式名稱為COVID-19(coronavirus disease 2019)，為一種新型冠狀病毒(原名2019-nCoV，現(xiàn)名SARS-CoV-2)感染引起的急性傳染病[1]。國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布了一系列診治方案，《國家方案》試行第三版提出了中醫(yī)藥治療的方案，并推薦了多個中成藥在診治過程中使用，以共同促進(jìn)COVID-19臨床療效的提高[2]。

金葉敗毒顆粒(Jinyebaidu granules，JYBDG)是華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院院內(nèi)制劑，是由金銀花、大青葉、蒲公英和魚腥草組成的。臨床上主要治療溫?zé)岵。貏e是上焦熱毒證，包括病毒性肺炎、急性上呼吸道感染、流行性感冒等急性病毒性疾病。還可以用于SARS病毒感染的預(yù)防和治療，取得了很好的預(yù)防效果[3]。本研究基于ADME參數(shù)和Lipinski規(guī)則對金葉敗毒顆粒的活性成分進(jìn)一步篩選，其活性成分與JYBDG作用于COVID-19的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，為后續(xù)研究提供參考方向，提高篩選效率。

1 材料與方法

1.1 基于ADME和“Lipinski 規(guī)則”評估

JYBDG 4味中藥通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，TCMID數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpid.org/)，BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行成分的獲取。本文利用Lipinski的五規(guī)則即分子量(MW<500)、脂水分配系數(shù)(AlogP<5)、氫鍵供體數(shù)(Hdon<5)、氫鍵受體數(shù)(Hacc<10)和旋轉(zhuǎn)鍵(RBN<10)篩選RDNI的活性成分[4,5]。為了確保JYBDG成分鑒定的準(zhǔn)確性和相關(guān)性，本文還納入了西北農(nóng)林科技大學(xué)系統(tǒng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室(陜西楊凌)的篩選標(biāo)準(zhǔn)[6]，即藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30、Caco-2 細(xì)胞滲透性>-0.4和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18。DL是與良好的臨床療效相關(guān)聯(lián)的物理化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)特性。DL越大，則成藥性越高[7]。對于通過口服途徑給藥的藥物，OB是最重要的藥代動力學(xué)參數(shù)之一，是衡量藥物進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng)有效性的一個重要指標(biāo)。良好的口服生物利用度是化合物具有藥理活性的基本前提之一[8]。

1.2 JYBDG活性成分作用靶點(diǎn)的篩選

JYBDG活性成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測及篩選活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)。然后，將所有靶點(diǎn)通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)以“homo sapiens”(人屬)為關(guān)鍵詞進(jìn)行基因-蛋白名稱轉(zhuǎn)化，即將全部蛋白名稱轉(zhuǎn)換為基因名稱。

1.3 獲取COVID-19相關(guān)的基因

基于The Human Gene Database(GeneCards)(https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫，以“novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞檢索與新型冠狀病毒肺炎的相關(guān)的基因。

1.4 JYBDG治療COVID-19潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測

以上“1.2和1.3”項(xiàng)下得到的靶點(diǎn)通過Venny2.1(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪圖軟件，將藥物預(yù)測的靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得“JYBDG”治療COVID-19的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)預(yù)測核心治療靶點(diǎn)

以上“1.4”項(xiàng)下得到的潛在靶點(diǎn)和作用于潛在靶點(diǎn)的活性成分及其來源的中藥通過Cytoscape3.7.1軟件(版本：3.7.1，https://cytoscape.org)構(gòu)建中藥-潛在成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(herb-potential compound-potential target，HB-pC-pT network)。并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)篩選JYBDG治療COVID-19的核心治療靶點(diǎn)，即以節(jié)點(diǎn)度值(degree)超過平均值為標(biāo)準(zhǔn)篩選出核心靶點(diǎn)。一個degree代表在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)直接相互作用的節(jié)點(diǎn)的數(shù)目。節(jié)點(diǎn)的大小與度數(shù)成正比。節(jié)點(diǎn)的度越大則其參與的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越強(qiáng)[9]。

1.6 基因富集分析

為了系統(tǒng)的闡明JYBDG治療COVID-19的作用，通過DAVID數(shù)據(jù)庫(版本：6.8，https://david.ncifcrf.gov/)對以上“1.4”項(xiàng)下得到的潛在靶點(diǎn)基因功能(GO)和相關(guān)通路(pathway)進(jìn)行富集分析。

1.7 受體與配體的前處理及分子對接

1.7.1 配體前處理

借助ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org/)對“1.1”項(xiàng)下得到的活性成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，并以mol格式文件保存。在PyMol軟件(https://pymol.org/)中檢查空間結(jié)構(gòu)無誤后，轉(zhuǎn)換為pdb格式。將結(jié)構(gòu)件載入AutoDock Tools 1.5.6程序，添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均默認(rèn)可旋轉(zhuǎn)，保存為pdbqt格式，作為對接配體。

1.7.2 受體前處理

采用AutoTools對以上“1.5”項(xiàng)下收集的治療核心靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行預(yù)處理，刪除多余的蛋白鏈和配體、加氫去除水分子，計算Gasteiger電荷，保存為pdbqt文件，作為用于做分子對接的受體。

1.7.3 分子對接

以上預(yù)處理的配體和受體使用Autodock Vina(版本：1.2，http://vina.scripps.edu/index.html)進(jìn)行小分子與蛋白對接。最后取優(yōu)勢構(gòu)象進(jìn)行分析，并用Schrodinger(https://www.schrodinger.com)軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 金葉敗毒顆?；钚猿煞址肿訋旌Y選

JYBDG的4味中藥通過TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫收集445個成分，其中248個來自金銀花，75個來自大青葉，72個來自蒲公英，50個來自魚腥草(表1)。將成分通過ADME和“Lipinski規(guī)則”篩選得到47個活性成分，其中3個來自大青葉，3個來自魚腥草和41個來自金銀花(表2)。

表1 JYBDG 4味中藥的總成分Table 1 Total compounds of 4 herbs of JYBDG

表2 JYBDG活性成分的ADME篩選Table 2 Candidate compounds from JYBDG screened by ADME

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.2 活性成分作用靶點(diǎn)的獲取

以上得到的47個活性成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到392靶點(diǎn)，此靶點(diǎn)通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因名稱-蛋白名稱轉(zhuǎn)換，并刪除重復(fù)的靶點(diǎn)名稱后得到128個作用靶點(diǎn)。

2.3 預(yù)測JYBDG治療COVID-19的靶點(diǎn)結(jié)果

根據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索COVID-19的治療靶點(diǎn)，得到251個COVID-19的治療靶點(diǎn)。運(yùn)用Venny2.1軟件將JYBDG的作用靶點(diǎn)與COVID-19的治療靶點(diǎn)取交集，得到20個JYBDG治療COVID-19的潛在靶點(diǎn)(見圖1)。

圖1 JYBDG治療新型冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 The venn diagram of targets in treatment of COVID-19 with JYBDG

2.4 HB-pC-pT 網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)的篩選

以上獲取的20個潛在靶點(diǎn)對應(yīng)的成分有18個，來源于金銀花、大青葉和魚腥草。3個中藥、18個潛在成分及其20個潛在靶點(diǎn)通過Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建HB-pC-pT網(wǎng)絡(luò)，以闡明中藥、潛在成分和潛在靶點(diǎn)之間的關(guān)系(圖2)。該網(wǎng)絡(luò)由41個節(jié)點(diǎn)(3個中藥、18個潛在成分和20個潛在靶點(diǎn))和71個邊緣組成。HB(綠色八角形)、pC(黃色四角形)和pT(紅色圓形)之間的邊緣代表相互作用。節(jié)點(diǎn)代表蛋白，邊代表功能的相關(guān)性，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大。對于成分而言，山奈酚(kaempferol)、甘草酚(glycyrol)和靛玉紅(indirubin)擁有超過5個靶點(diǎn)，說明在這個網(wǎng)絡(luò)中應(yīng)存在著能夠作用于JYBDG大部分作用靶點(diǎn)的少數(shù)關(guān)鍵化合物。可能代表這個組方的大部分療效，即可能是JYBDG的主要療效物質(zhì)。從靶點(diǎn)的角度來看，靶點(diǎn)平均節(jié)點(diǎn)度值為2.9，超過平均度值的靶點(diǎn)有5個，包括PTGS2(degree=16)、PTGS1(degree=8)、NOS3(degree=3)、PPARG(degree=3)和NOS2(degree=3)。圖2中靶點(diǎn)的degree值大小和與圈形大小成正比。Degree值大的靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵的作用，其很可能是JYBDG治療COVID-19的核心靶點(diǎn)。

圖2 中藥-潛在成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 HB-pC-pT network

2.5 基因富集分析結(jié)果

20個潛在靶點(diǎn)通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，共富集出256條生物功能信息。其中生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)等GO生物功能有189條，信號通路有67條。為了更精準(zhǔn)了解JYBDG治療COVID-19可能的作用機(jī)制，KEGG信號通路以FDR≤0.01(錯誤發(fā)現(xiàn)率)為條件進(jìn)一步篩選，F(xiàn)DR表示在富集分析中越小，就代表富集顯著程度就越高。如表2所示，獲得16條信號通路，將FDR值由低到高排序。

表3 6條顯著富集的KEGG通路(FDR≤0.01)Table 3 Sixteen significantly enriched KEGG pathways (FDR ≤ 0.01)

續(xù)表3(Continued Tab.3)

2.6 分子對接分析結(jié)果

將JYBDG的47個活性成分在通過ZNIC數(shù)據(jù)庫以mol格式保存、在PyMol軟件以pdb格式保存、在AutoDock Tools 1.5.6程序以為pdbqt格式保存過程中，至保留了38個成分。以JYBDG的38個活性成分作為配體，以“2.4”項(xiàng)下得到的5個核心治療靶點(diǎn)為受體，進(jìn)行分子對接 按照結(jié)合能(score)來判斷活性成分與靶點(diǎn)的匹配度，一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生的作用可能性越大[10]。以score≤-7.0 kJ/mol 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。表4結(jié)果顯示，甘草酚(glycyrol)、junipene(MOL002697)和山奈酚(kaempferol)均與PTGS2，BNL(MOL003056)和山奈酚與NOS2以及BNL與PTGS1具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。為了證實(shí)JYBDG的主要活性成分通過與相關(guān)蛋白相互作用治療COVID-19的潛在療效，進(jìn)一步進(jìn)行分析結(jié)合模型，表中可以看出來，氫鍵和pi-pi相互作用對小分子與蛋白的識別和穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用，計算分析進(jìn)一步闡明了活性成分與蛋白之間精確的分子機(jī)制。

表4 JYBDG活性成分與作用于COVID-19核心靶點(diǎn)的分子對接(結(jié)合能≤-7.0 kJ/mol)Table 4 Molecular docking of JYBDG active components with COVID-19 core targets (binding energy≤-7.0 kJ /mol)

續(xù)表4(Continued Tab.4)

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為COVID-19屬于“濕毒疫”范疇，源于感受“濕毒之邪”致病。在中醫(yī)“辨證施治”理論指導(dǎo)下，中藥在“濕毒疫”的運(yùn)用具有獨(dú)特的優(yōu)勢[11]。本文運(yùn)用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，在金葉敗毒顆?；钚猿煞值腁DME和Lipinski五項(xiàng)規(guī)則的基礎(chǔ)上，結(jié)合各種中藥的法定質(zhì)量控制指標(biāo)，篩選整合分析并建立可靠的成分庫。以COVID-19為疾病模型，借助分子對接技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建相應(yīng)的藥理網(wǎng)絡(luò)。

金葉敗毒顆粒藥味簡單，均是寒性藥物，根據(jù)“熱著寒之”的治療原則，可用于溫?zé)岵?。方中金銀花性甘寒，既能清熱解毒，又可疏散風(fēng)熱，治療外感風(fēng)熱、溫病初起。近期研究報道[12]，通過SARS-CoV-2 3CL水解酶的中藥小分子抑制劑，作者根據(jù)多地市制定的中醫(yī)藥治療方案進(jìn)行統(tǒng)計，推測的12種中藥復(fù)方中10種復(fù)方均包含金銀花。又研究報道[13]，預(yù)防COVID-19的44個方劑中，金銀花使用頻次有23次，排名第3位。大青葉性寒具有清熱解毒、涼血消斑的功效。對各種病毒有抑制感染并有抑制增殖作用[14]。魚腥草具有清熱解毒、利尿通淋等功效。抗菌和抗病毒作用明顯，臨床用于肺癰吐膿、痰熱喘咳，熱痢和熱淋等[15]。

HB-pC-pT 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，山奈酚、甘草酚和靛玉紅可能是JYBDG的主要療效物質(zhì)。其中山奈酚和靛玉紅已有報道具有抗炎、抗病毒和抗腫瘤作用[16,17]。本課題組前期報道[18]，山奈酚同時與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2具有較好的結(jié)合活性。且作用于PTGS2、PTGS1、NOS3、PPARG和NOS2等5個核心治療靶點(diǎn)。進(jìn)一步確定山奈酚可能作用于COVID-19的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，靛玉紅以及分子對接結(jié)果較好的junipene和BNL等主要活性成分與COVID-19尚未相關(guān)研究報道，待進(jìn)一步研究。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，JYBDG活性成分作用的潛在靶點(diǎn)主要參與TNF 信號通路、弓形體病、肺結(jié)核和甲型流感等，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，上述通路涉及病毒、細(xì)菌、免疫調(diào)節(jié)腫瘤和炎癥等各個方面。

綜上所述，從中可以看出JYBDG治療COVID-19是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用來發(fā)揮療效的。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性，需要開展實(shí)驗(yàn)研究，為JYBDG治療COVID-19以及后期的藥物開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。