劉曉東，李海山，孟 川，王玉海，吳 芳，牟金貴，馬俊賢,王明秋

(1.河北省農(nóng)林科學院 經(jīng)濟作物研究所，河北省蔬菜工程技術中心，河北 石家莊 050051；2.河北省農(nóng)林科學院， 河北 石家莊 050031;3.河北省市場監(jiān)督管理局,河北 石家莊 050091)

大白菜(Brassicarapapekinensis)是我國北方重要的蔬菜作物，育種方式仍以雜交育種為主，重點在于雜交親本的選育。經(jīng)歷了自交系育種、自交不親和系育種、雄性不育系育種3個階段，通過回交轉育、抗病聚合、品質篩選等多種技術手段，實現(xiàn)了新資源、新品種的創(chuàng)新選育。利用植物雄性不育系進行雜交種的選育，已成為當前育種的主要手段之一。自20世紀70年代中國學者開展大白菜雄性不育系的選育與利用以來，先后有譚其猛[1]、張書芳[2]、馮輝[3]、柯桂蘭[4]、孫日飛[5]、張德雙[6]等分別育成了核隱性雄性不育系、核基因互作型雄性不育系、復等位基因型雄性不育系、甘藍型油菜PolCMS、新型蘿卜胞質CMS、新型甘藍型油菜CMS等材料，并育成了相關的品種。

然而在雄性不育系選育與利用過程中仍然存在一些問題，如利用核隱性雄性不育系制種，不育系存在50%的可育株，不但雜交種純度難以保障，拔除可育株[7-8]費工費力而且降低單位面積產(chǎn)量；采用100%核基因雄性不育系，因采用三系配套，雜交制種實際上為三交種，若甲型“兩用系”與“保持系”遺傳基礎差距較大時，易出現(xiàn)F1不整齊現(xiàn)象[9]；采用PolCMS不育系配制雜交種，因PolCMS具有對環(huán)境敏感的特性，在溫度變化時極易恢復育性，造成雜交純度降低的問題[10]。而新型甘藍型油菜CMS具有不育性穩(wěn)定、蜜腺正常、配合力好的特點，可以作為大白菜細胞質不育系材料創(chuàng)制的不育源。

目前，采用分子標記的方法對不同細胞質不育類型進行鑒定，主要利用與目標性狀緊密連鎖的遺傳標記，進行分子鑒定，存在需要從蘿卜OguCMS特異性核苷酸序列orf138[11]，甘藍型油菜PolCMS特異性核苷酸序列orf222[12]、orf224[13]中選取多對標記引物才能從大白菜細胞質雄性不育系中鑒定出新型甘藍型油菜CMS的問題，本研究通過設計開發(fā)了一對引物即可快速鑒定新型甘藍型油菜CMS的分子標記，以不同時期回交轉育獲得的不同類型雄性不育系材料為試材，以現(xiàn)有的引物進行分子標記鑒定為對照，建立了一種快速鑒定新型甘藍型油菜CMS的方法，并對回交轉育了該基因的雄性不育系材料進行了鑒定。

1 材料和方法

本試驗于2014年8月11日對CMS-AM41、CMS-AQ29、CMS后36高進行播種，苗期選取細胞分生能力最強的大小約2 cm2柔嫩心葉，每株1～2 g，進行DNA提取。依據(jù)orf138、orf222、orf2243個基因序列，通過現(xiàn)有技術引物擴增分子標記進行不育類型分析鑒定，篩選出新型甘藍型油菜CMS不育材料。以設計的新引物分子標記鑒定轉育四倍體不育系CMS-D571、CMS-D574和相應保持系D571、D574。

通過對比orf138、orf222、orf2243個線粒體特異核苷酸序列，采用引入錯配堿基的方法[14]，設計專用型引物，并對利用新型甘藍型油菜CMS轉育的四倍體雄性不育系進行鑒定。

試驗采用CTAB基因提取法[15]提取待測樣品的基因組DNA，以待測細胞質雄性不育系大白菜樣品的基因組DNA為模板，以不同引物進行PCR擴增。PCR的反應體系為：總體積20 μL，Buffer 2.0 μL，dNTP 0.4 μL，正反引物(10×)各0.5 μL，gDNA(2.5～5.0 ng/μL)模板1 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O補齊至20 μL。

PCR反應試劑Buffer、TaqDNA聚合酶為北京全式金公司Trans Gen Biotech的PCR反應試劑盒；反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃復性30 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存10 min[16-18]。

核苷酸序列通過在線序列比對軟件MulAlin對其進行比對。

擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測：將PCR產(chǎn)物用加有EB(溴化乙啶)的1%瓊脂糖在100～120 V的電壓下電泳30～40 min，最終在凝膠成像系統(tǒng)上顯示。

2 結果與分析

2.1 大白菜新型甘藍型油菜CMS不育材料的篩選

對3種不育類型的CMS-AM41、CMS-AQ29、CMS后36高鑒定采用現(xiàn)有的技術引物開展RAPD分子標記，依據(jù)3種不育類型基因特異片段orf138、orf222、orf224的差異性設計出引物，利用orf138、orf222、orf224擴增的引物核苷酸序列如表1所示。

經(jīng)PCR擴增電泳凝膠成像顯示，由圖1可知泳道1-3為CMS后36高3次重復，利用orf138和orf222的2種引物擴增后，分別擴增出300，700 bp的DNA片段，表明CMS后36高為新型甘藍型油菜CMS類型；泳道4-6為CMS-AQ293次重復，利用orf138的引物未擴增出DNA片段，而利用orf222的引物擴增出了700 bp的DNA序列，且利用orf224的引物擴增出了650 bp的DNA片段，準確表明CMS-AQ29為PolCMS類型；泳道7，8為CMS-AM41的保持系M41的2次重復，3種引物均未擴增出DNA片段，表明M41為自交系，與實際吻合；泳道9，10為CMS-AM41的2次重復，利用orf138的引物擴增出了300 bp的DNA片段，而利用orf222的引物并未擴增出DNA序列，表明CMS-AM41為OguCMS類型。CMS后36高為篩選的特定雄性不育源。

表1 利用orf138、orf222、orf224基因片段擴增引物Tab.1 Primer amplification according to orf138, orf222, orf224

M.Marker;1-3.CMS后36高；4-6.CMS-AQ29；7,8.M41；9,10.CMS-AM41。 M.Marker; 1-3.CMS hou36gao; 4-6.CMS-AQ29; 7,8.M41; 9,10.CMS-AM41.

2.2 Pol CMS與新型甘藍型油菜CMS經(jīng)PCR擴增產(chǎn)物核苷酸序列差異分析

依據(jù)現(xiàn)有技術中orf222引物在PolCMS與新型甘藍型油菜CMS的大白菜DNA中均能擴增出700 bp左右的片段，經(jīng)測序對比2種類型雄性不育系PCR擴增產(chǎn)物的核苷酸序列，篩選差異序列。

以提取的分別含有PolCMS不育基因的CMS-AQ29基因組DNA和含有新型甘藍型油菜CMS不育基因的CMS后36高基因組DNA為模板，通過引物orf222進行PCR擴增， 經(jīng)在線序列對比軟件MulAlin對其進行比對，如圖2所示，2組序列同源性高達84.44%，差異性較明顯的序列片段位于180～210 bp。

圖2 CMS后36高與CMS-AQ29擴增核苷酸序列差異性對比Fig.2 Comparison of CMS hou36gao and CMS-AQ29 amplified nucleotide sequences

2.3 新型甘藍型油菜CMS專用引物O-2的設計

依據(jù)擴增產(chǎn)物核苷酸序列orf222-Pol和orf222-New CMS(圖2)設計引物。在其上游引物 Fw:5′-AAGCTTGGTGGAAAAGATCGTA-3′的3′端引入T/G錯配堿基，引入后序列變更為Fw:5′-AAGCTTGGT GGAAAAGATCGGA-3′，堿基錯配降低了引物與其3′末端互補模板之間的延伸。從而使得新設計的引物不能以甘藍型油菜PolCMS的大白菜DNA為模板進行擴增，因此,成為鑒定新型甘藍型油菜CMS大白菜的特異引物。該引物定名為“O-2”，其核苷酸序列為：

Fw: 5′-AAGCTTGGTGGAAAAGATCGGA-3′，Rv: 5′-GATTTCGTTCACCTTGGCTCT-3′。

以提取的CMS后36高基因組DNA為模板，通過引物O-2進行PCR擴增，大小為474 bp,核苷酸測序如圖3所示。

2.4 不同引物分子標記鑒定新型甘藍型油菜雄性不育系及其保持系

以轉育了新型甘藍型油菜CMS的四倍體大白菜材料 CMS-D571、CMS-D574和相應的保持系D571、D574為試材，通過現(xiàn)有技術引物進行分子標記，如圖4所示，經(jīng)orf138、orf222鑒定，CMS-D571>(泳道1-3)、CMS-D574(泳道9，10)分別在300，700 bp處形成亮帶，而orf224相應位置無亮帶，表明CMS-D571、CMS-D574成功轉育為了新型甘藍型油菜CMS，而保持系D571(泳道4-6)、D574(泳道7，8)試驗中未檢出相關基因。

圖3 利用新型引物 O-2 擴增出的核苷酸序列Fig.3 Nucleotide sequences amplified using novel primer O-2

M.Marker;1-3.CMS-D571；4-6.D571；7,8.D574；9,10.CMS-D574；11.ddH2O。圖5同。 M.Marker; 1-3.CMS-D571; 4-6.D571; 7,8.D574; 9,10.CMS-D574; 11.ddH2O.The same as Fig.5.

分別以CMS-D571、D571、D574、CMS-D574的DNA為模板，通過設計的新型引物O-2進行核苷酸序列擴增，經(jīng)凝膠電泳檢測，結果如圖5所示。CMS-D571和CMS-D574均在470 bp處擴增出了產(chǎn)物，證實為成功轉育了新型甘藍型油菜CMS的雄性不育系材料，而保持系D571和D574則未擴增出產(chǎn)物，為自交系材料。

圖5 采用O-2引物對CMS-D571、D571、D574、 CMS-D574雄性不育分子標記鑒定Fig.5 Molecular marker identification of male sterility lines CMS-D571, D571, D574, CMS-D574 by O-2 primer

3 討論

張德雙[19]、王國芳等[20]對3種不育類型的鑒定采用RAPD分子標記法，找出3種不育類型基因的特異片段進行測序，根據(jù)核苷酸系列的差異性設計引物，并轉換為SCAR標記：orf138、orf222、orf224。但orf138在OguCMS與新型甘藍型油菜CMS的DNA序列中均能擴增出300 bp大小的片段。orf222在PolCMS與新型甘藍型油菜CMS的DNA序列中同樣能擴增出700 bp大小的片段，orf224只能在PolCMS的DNA序列中能擴增出650 bp大小片段。

本研究通過采用現(xiàn)有技術引物，從已掌握的二倍體大白菜細胞質雄性不育系中篩選出了含有新型甘藍型油菜CMS的不育系材料CMS后36高和含有PolCMS不育基因的CMS-AQ29，通過核苷酸測序對比，篩選出了位于180～210 bp差異性較明顯的序列片段。通過堿基錯配，設計開發(fā)了一對引物O-2，對轉育了新型甘藍型油菜CMS的大白菜材料進行PCR核苷酸擴增，經(jīng)電泳凝膠成像可在470 bp處形成亮帶，而新引物不能以PolCMS的大白菜DNA為模板進行擴增，成為鑒定新型甘藍型油菜CMS大白菜的特異引物。

利用該引物建立的快速鑒定新型甘藍型油菜CMS的方法，擴增出的條帶清晰，該分子標記具有簡單、穩(wěn)定可靠、重復性好等優(yōu)點，從DNA水平上鑒定了細胞質雄性不育系的大白菜品種，提高了準確性。相對于現(xiàn)有技術中需要多對引物才能鑒定大白菜是否為新型甘藍型油菜CMS的問題，大大減少了鑒定工作量，提高了檢測效率，對于促進利用大白菜雄性不育系育種進程具有重要意義。