孫 鵬，唐保軍，姜亞洲

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090）

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，魚類常受到諸多環(huán)境因素的影響。養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中所涉及的捕捉、排污、運(yùn)輸?shù)炔僮鞫际遣豢杀苊獾?，這些操作環(huán)節(jié)也會(huì)對魚類造成一定的脅迫作用，致使養(yǎng)殖魚類應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生［1］。應(yīng)激（stress）是生物體遭受環(huán)境刺激時(shí)出現(xiàn)的非特異性生理反應(yīng)，是機(jī)體的一種防御機(jī)制。適當(dāng)?shù)膽?yīng)激源刺激有助于機(jī)體快速適應(yīng)環(huán)境變化，但若超出機(jī)體自身的適應(yīng)范圍，則會(huì)造成機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，誘發(fā)疾病或致使疾病發(fā)展、惡化［2］。養(yǎng)殖生產(chǎn)中許多難以根治的頑固性疾病往往是魚類長期處于應(yīng)激狀態(tài)的結(jié)果，必須引起高度重視。近年來，養(yǎng)殖應(yīng)激相關(guān)研究逐漸開展起來［3-6］。

大黃魚（Larimichthys crocea）屬于鱸形目（Perciformes），石首魚科（Sciaenidae），黃魚屬，是我國近海重要的經(jīng)濟(jì)魚類，也是浙江、福建、廣東等東南沿海省份重要的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類。由于其對多種外界環(huán)境因素敏感，養(yǎng)殖和管理過程中引起的應(yīng)激反應(yīng)影響已經(jīng)成為一個(gè)亟待解決的突出性問題，這也給養(yǎng)殖管理造成了一定的困難［1，7］。近年來，大黃魚環(huán)境脅迫相關(guān)研究已有報(bào)道，其主要涉及水體、溫度和養(yǎng)殖密度等［7-9］，而對于捕捉、排污、驚擾等生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的容易被忽視的常見因素引起的脅迫應(yīng)激研究相對較少［1］，關(guān)于其應(yīng)激過程中魚體的生理變化規(guī)律也知之甚少。為此，本研究通過分析人工驚擾狀態(tài)下大黃魚體內(nèi)重要生理生化指標(biāo)及抗氧化酶活力變化，探討了應(yīng)激狀態(tài)下魚體對應(yīng)激反應(yīng)的適應(yīng)性響應(yīng)，研究結(jié)果可為大黃魚健康養(yǎng)殖生產(chǎn)提供信息支持，也可為魚類脅迫應(yīng)答機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)魚為福建省寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司人工繁育的大黃魚成體，平均體質(zhì)量為（88.91±9.27）g，挑選體色正常、無傷無病、行動(dòng)迅速、生命力強(qiáng)的個(gè)體用于脅迫實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前于室內(nèi)水泥池（6.0 m×4.0 m×1.5 m）中養(yǎng)殖，實(shí)驗(yàn)用海水經(jīng)過砂濾處理［鹽度25.7±0.5，水溫（25.6±0.5）℃］；采用連續(xù)充氣，每日換水1次，換水量2/3，每日投喂顆粒飼料2次（8∶00和14∶00）。

1.2 脅迫實(shí)驗(yàn)和取樣

實(shí)驗(yàn)時(shí)，將暫養(yǎng)的大黃魚放入10組1 t的PVE桶中，每桶加入海水700 L，并放入試驗(yàn)魚30尾。隨機(jī)選擇其中1組作為對照組，其余的9組作為無差別的處理組，每組內(nèi)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。并在隨后的取樣過程中，每次從未取過樣的一組中采集樣品，以避免因取樣造成的密度等因素對實(shí)驗(yàn)測定的干擾。驚擾處理一共持續(xù)10 d，處理方法參照翁朝紅等［1］，并做了部分改進(jìn)。每日定時(shí)采用1 m長的PVE管（直徑2 cm）快速繞桶壁驅(qū)趕試驗(yàn)魚10 min，再將桶中的大黃魚用抄網(wǎng)捕捉并暴露于空氣中10 s。為盡量保證脅迫強(qiáng)度的定量，追趕速度設(shè)定為每3 s繞PVE桶旋轉(zhuǎn)驅(qū)趕2圈。

分別在處理后第0、3、6、24、48、72、96、120、240小時(shí)對試驗(yàn)魚進(jìn)行取樣。取樣過程中，每次從1組PVE桶隨機(jī)選取6尾大黃魚并用MS-222進(jìn)行麻醉，經(jīng)靜脈取血后解剖取肝臟組織，準(zhǔn)確稱重后按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入生理鹽水，經(jīng)勻漿（冰水?。┖碗x心（2 500 r·min-1，10 min）后取得上清液待測。對樣品魚肝臟中總蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）進(jìn)行測定，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次；血液樣品置于1.5 mL離心管中，4℃靜置8 h后離心（3 000 r·min-1，10 min），收集上層血清用于生化指標(biāo)測定。皮質(zhì)醇含量采用ELISA方法測定，SOD和血糖含量采用比色法，CAT、溶菌酶和乳酸含量采用分光光度法測定，所需試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所，并參照說明書進(jìn)行操作。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得的全部數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SD）的形式。利用SPSS 25.0軟件中的方差分析和Duncan氏檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，P＜0.05時(shí)被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚血清皮質(zhì)醇的變化

應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚血清中的皮質(zhì)醇含量變化如圖1所示。在驚擾處理后，大黃魚血清中皮質(zhì)醇含量快速升高，在處理3 h后其含量開始顯著高于對照組（P＜0.05），在處理6 h后達(dá)到最高峰；之后，皮質(zhì)醇含量逐漸降低，雖然期間含量也高于對照水平，但與對照組并無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚的皮質(zhì)醇含量變化Fig.1 Changes of cortisol concentration in Larim ichthys crocea under stress

2.2 應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚血糖和乳酸含量的變化

應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚血清中的血糖含量也隨著處理時(shí)間的延長出現(xiàn)顯著變化。如圖2所示，驚擾處理3 h時(shí)大黃魚血清中血糖含量快速升高，其含量在處理后的72 h一直處于較高水平并顯著高于對照組（P＜0.05）；在處理72 h后，血糖含量開始降低并恢復(fù)至驚擾處理前水平。

應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚血清中的乳酸含量也出現(xiàn)與血糖含量相近的變化（圖3）。自處理后3 h開始，大黃魚血清中乳酸含量快速升高，并在處理后6 h處于最高水平（P＜0.05）；高乳酸狀態(tài)一直持續(xù)到驚擾處理后48 h，之后也逐漸降低并恢復(fù)至脅迫處理前水平。

圖2 應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚的血糖含量變化Fig.2 Changes of glucose concentration in Larim ichthys crocea under stress

圖3 應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚的乳酸含量變化Fig.3 Canges of lactic acid concentration in Larim ichthys crocea under stress

2.3 應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚肝臟抗氧化酶活力的變化

驚擾處理后，大黃魚在應(yīng)激狀態(tài)下的肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性也呈現(xiàn)升高的趨勢（圖4）。在脅迫處理的第1天，肝臟中SOD酶活力隨處理時(shí)間的推移而逐漸升高，并在處理后6 h達(dá)到最高峰值，這種顯著性增高的趨勢一直持續(xù)到處理后24 h；隨后，SOD活力開始下降，最終的酶活力水平稍高于對照組，但差異并不顯著（P＞0.05）。

與肝臟中SOD酶活力變化趨勢不同，應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚過氧化氫酶（CAT）活力（圖5）在驚擾處理后第1天并未出現(xiàn)顯著性變化；在處理后第2天，酶活力開始逐漸升高，在處理后第3天開始顯著高于對照組酶活力（P＜0.05），并在處理后第5天（120 h）達(dá)到最高值；之后，CAT活力一直保持較高的水平，且在脅迫處理的第10天仍顯著高于對照組水平（P＜0.05）。

圖4 應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚的超氧化物歧化酶含量變化Fig.4 Changes of SOD activity in Larim ichthys crocea under stress

圖5 應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚的過氧化氫酶活力變化Fig.5 Changes of CAT activity in Larim ichthys crocea under stress

2.4 應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚溶菌酶的變化

驚擾脅迫處理后，大黃魚溶菌酶活力變化趨勢如圖6所示。在驚擾處理后第1天大黃魚血清中溶菌酶活力逐漸升高，在處理后第6小時(shí)達(dá)到最高值，并顯著高于對照組水平（P＜0.05）；隨后，溶菌酶活力又開始下降至對照組水平；然后，溶菌酶活力在應(yīng)激反應(yīng)第3天和第4天又開始升高并維持較高的水平狀態(tài)（P＜0.05）；在驚擾處理的第10天，溶菌酶活力仍高于對照組水平，但差異并不顯著（P＞0.05）。

圖6 應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚的溶菌酶含量變化Fig.6 Changes of lysozyme concentration in Larim ichthys crocea under stress

3 討論

魚類屬于水生低等變溫脊椎動(dòng)物，生存容易受到外源環(huán)境因素影響。目前，日益惡化的環(huán)境對魚類造成的影響已成為一個(gè)突出性問題［2］。同樣，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中魚類也常受到多種環(huán)境因素的影響，繼而引發(fā)魚體的應(yīng)激反應(yīng)［10-11］。應(yīng)激反應(yīng)可分為3級：初級應(yīng)激反應(yīng)是魚類神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)水平上的反應(yīng)，主要表現(xiàn)為血清腎上腺素或去腎上腺素以及皮質(zhì)醇含量顯著升高；次級應(yīng)激反應(yīng)為初級反應(yīng)引起的呼吸系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等各組織與器官方面的變化；而第三級應(yīng)激反應(yīng)是在次級應(yīng)激反應(yīng)基礎(chǔ)上導(dǎo)致的如生長速率、抗病能力、繁殖能力及行為等個(gè)體以及群體方面的改變。

魚體接收到外界脅迫信號后，首先由其下丘腦產(chǎn)生促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）傳遞給腦垂體，腦垂體前葉受到CRH刺激分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH），并傳遞給腎間組織，再由腎間組織產(chǎn)生以皮質(zhì)醇為主的皮質(zhì)類固醇，并釋放到血液中去引發(fā)其他反應(yīng)。皮質(zhì)醇是參與魚體應(yīng)激反應(yīng)過程的重要激素，其含量的快速升高已見于多種魚類脅迫應(yīng)激相關(guān)報(bào)道［12-13］。皮質(zhì)醇通過代謝調(diào)節(jié)，可促進(jìn)糖元、蛋白質(zhì)和脂肪分解以應(yīng)對應(yīng)激反應(yīng)。但皮質(zhì)醇同時(shí)還具有免疫抑制和抗炎功能，應(yīng)激和適應(yīng)過程中血清皮質(zhì)醇濃度升高往往也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降。例如，大西洋鮭（Salmo salarLinnaeus）經(jīng)過操作脅迫處理后，隨著皮質(zhì)醇含量的升高，免疫細(xì)胞中IL-1β等基因會(huì)出現(xiàn)過表達(dá)，繼而降低白細(xì)胞在外界病原入侵時(shí)候的存活力［14］。本研究中，大黃魚經(jīng)驚擾脅迫處理后，皮質(zhì)醇含量也快速升高，并在脅迫處理6 h時(shí)達(dá)到最高峰，這是大黃魚經(jīng)外界人工干擾后的初級應(yīng)激反應(yīng)；之后，隨著魚體對外界刺激的逐步適應(yīng)，皮質(zhì)醇含量也逐漸降低并最終恢復(fù)到處理前水平，這有利于魚體對自身內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持，同時(shí)也體現(xiàn)了大黃魚對長期應(yīng)激狀態(tài)的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。

血糖是血液中重要的能源物質(zhì)，為魚體進(jìn)行各種生命活動(dòng)所需能量的直接來源。大黃魚在應(yīng)激狀態(tài)下血清中血糖含量顯著增加，推測魚體在受到外界刺激后能量消耗劇增，體內(nèi)代謝加快，糖原消耗加速；同時(shí)，皮質(zhì)醇含量的增加將促進(jìn)肝臟糖異生作用并降低各組織對血糖的利用率，這都將導(dǎo)致大黃魚血液中血糖含量快速升高，為機(jī)體應(yīng)對外界環(huán)境變化提供能量。相似的情況也出現(xiàn)在脅迫后的銀鯧（Pampus argenteus）［12-13］、大西洋鮭［14-15］等魚類中，以保障機(jī)體可以經(jīng)受住外界因素刺激，快速調(diào)節(jié)機(jī)體以適應(yīng)外界環(huán)境并維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。乳酸主要在肌肉供氧不足的情況下由糖酵解產(chǎn)生［12］。在劇烈運(yùn)動(dòng)的狀態(tài)下，糖酵解可迅速為機(jī)體提供能量。大黃魚經(jīng)人工追趕和空氣暴露處理后，魚群受驚并表現(xiàn)為呼吸急促和快速游動(dòng)，這都可導(dǎo)致魚體內(nèi)乳酸含量的升高。

溶菌酶是一種堿性蛋白，它可通過水解革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖使之裂解并釋放出來，以破壞和消除侵入體內(nèi)的外源性物質(zhì)。研究表明，在急性脅迫情況下溶菌酶活性可以作為魚類應(yīng)激程度的指示信號［16］。例如，在渾濁的水體中半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）肝臟內(nèi)溶菌酶活性隨著懸浮物濃度升高和處理時(shí)間延長而顯著增加［17］。本研究也發(fā)現(xiàn)，大黃魚受脅迫后溶菌酶也呈現(xiàn)活力升高的趨勢，推測這與應(yīng)激狀態(tài)下魚體的免疫防御行為有關(guān)。隨著魚體對外界刺激的響應(yīng)，體內(nèi)需消耗大量能量以調(diào)整和適應(yīng)新的環(huán)境，魚體的氧化損傷以及免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化可能降低機(jī)體對外源病原菌的殺傷力。這時(shí)，為抵御和消除病原菌侵入所造成的傷害，作為先天性防御系統(tǒng)重要成員的溶菌酶通過增加活力以抵御外界病原的影響。然而，詳細(xì)的情況尚待進(jìn)一步研究。魚類的新陳代謝活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生自由基（ROS），它是機(jī)體正常代謝的副產(chǎn)物。通常情況下，體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和抗氧化過程處于動(dòng)態(tài)平衡中。在魚體受到外界刺激而引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，機(jī)體內(nèi)的ROS會(huì)迅速積累。當(dāng)體內(nèi)的自由基含量積累到一定程度且超過機(jī)體的清除能力時(shí)，則會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激（oxidative stress），對魚體的脂類、蛋白質(zhì)和DNA造成氧化損傷［18］。自由基導(dǎo)致的氧化損傷不僅能造成細(xì)胞膜損傷，還可以使多種酶功能失活，從而削弱機(jī)體的免疫能力［19-21］。SOD和CAT在清除自由基方面發(fā)揮著重要作用，對機(jī)體細(xì)胞損傷后的氧化過程和吞噬作用具有很強(qiáng)的防御功能［22-23］。其中，SOD被認(rèn)為是率先起作用的抗氧化酶之一，是超氧陰離子自由基（O2-）的天然消除劑。本研究發(fā)現(xiàn)，在驚擾脅迫處理第1天，大黃魚肝臟中SOD酶活力隨著處理時(shí)間的延長而顯著增加，表明SOD在大黃魚的應(yīng)激調(diào)節(jié)和適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的抗氧化作用；之后，隨著機(jī)體對外界刺激的逐漸適應(yīng)和調(diào)節(jié)，SOD活力逐漸恢復(fù)至實(shí)驗(yàn)前的水平。SOD清除過程中產(chǎn)生的H2O2能在CAT的催化下生成H2O和O2，故CAT活力的整體升高趨勢遲于SOD；與SOD活力變化規(guī)律不同，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束CAT含量一直顯著高于對照組，表明長期的應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致大黃魚體內(nèi)自由基含量一直處于較高的水平，而這必然會(huì)導(dǎo)致大黃魚細(xì)胞損傷進(jìn)而影響其免疫防御機(jī)能。

在日常養(yǎng)殖實(shí)踐中，人們常認(rèn)為維護(hù)操作對魚體的影響較小，因而這些脅迫因素容易被忽視。本研究模擬了換水、清污和結(jié)網(wǎng)等操作過程中涉及的驚擾因素，從生理學(xué)角度分析了驚擾操作處理對大黃魚個(gè)體的影響，探討了大黃魚在應(yīng)激狀態(tài)下的適應(yīng)性響應(yīng)規(guī)律。研究顯示，人工驚擾操作可引起大黃魚應(yīng)激反應(yīng)，其應(yīng)激與適應(yīng)的過程涉及神經(jīng)內(nèi)分泌、能量代謝、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)在內(nèi)的多個(gè)系統(tǒng)的協(xié)同作用。其中涉及的生理指標(biāo)如皮質(zhì)醇、血糖、乳酸、SOD和CAT等均出現(xiàn)顯著性變化，體現(xiàn)了它們作為應(yīng)激反應(yīng)的生物指示劑的潛力［24］。在應(yīng)激反應(yīng)前期，大黃魚調(diào)節(jié)自身機(jī)能以應(yīng)對外界環(huán)境變化，魚體將逐漸適應(yīng)新環(huán)境，而體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)也逐漸趨于新的平衡；然而，長期處于應(yīng)激狀態(tài)勢必影響其能量供給和細(xì)胞健康，最終導(dǎo)致生長和抗病等方面機(jī)能的降低。