管 敏，姚金忠，張德志，唐大明，張厚本

（中國長江三峽集團(tuán)有限公司中華鱘研究所，三峽工程魚類資源保護(hù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443100）

亞硝酸鹽是廣泛存在于養(yǎng)殖水體中的一種物質(zhì)，它是自然環(huán)境中細(xì)菌硝化作用和脫氮作用過程中一種重要的中間產(chǎn)物［1］。在魚類的養(yǎng)殖過程中，高蛋白殘餌的溶解、高含氮排泄物的排放及硝化作用受阻等均能導(dǎo)致水體中亞硝酸鹽的不斷累積［2-3］。亞硝酸鹽通過被吸收和擴(kuò)散等方式進(jìn)入魚類體內(nèi)［4］，不僅能引起魚體痙攣、換氣過度等一系列的生理反應(yīng)［5］，還能嚴(yán)重降低魚類血液的載氧能力，導(dǎo)致多個(gè)器官受損、病變［6］。此外，亞硝酸鹽還能抑制魚類免疫系統(tǒng)的功能，導(dǎo)致魚類對病原菌的敏感性增加［7］，已成為制約魚類健康養(yǎng)殖的重要因素之一。

中華鱘（Acipenser sinensis）隸屬鱘科，鱘屬，是大型溯河產(chǎn)卵洄游性魚類，屬國家一級重點(diǎn)保護(hù)動物。20世紀(jì)70年代以來，由于受到人類活動的影響，中華鱘的自然種群嚴(yán)重衰退［8-9］。在此背景下，國內(nèi)多家研究機(jī)構(gòu)開展了大量關(guān)于中華鱘物種保護(hù)方面的研究工作。但在中華鱘的遷地養(yǎng)殖過程中，經(jīng)常出現(xiàn)養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽含量長期超標(biāo)的現(xiàn)象，這會對中華鱘造成一定程度的慢性脅迫，致其生長緩慢，爆發(fā)病害，甚至死亡，已對中華鱘的健康養(yǎng)殖造成很大影響。目前，有關(guān)環(huán)境脅迫對中華鱘生理健康影響的研究報(bào)道已有不少，主要集中在饑餓脅迫［10-11］、擁擠脅迫［10，12］、溫度脅迫［11-13］及慢性氨氮脅迫［14］等方面，但關(guān)于慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘抗氧化能力和免疫能力影響的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究慢性亞硝酸鹽脅迫條件下子二代中華鱘血清、肝臟抗氧化和免疫指標(biāo)的變化情況，旨在探討慢性亞硝酸鹽脅迫對其代謝水平和生理狀況的影響，從而為深入研究中華鱘應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)理提供理論依據(jù)，為子二代中華鱘的健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)魚為湖北省宜昌市中華鱘研究所2014年全人工繁殖所得的子二代中華鱘（3+齡）。隨機(jī)挑選規(guī)格一致、體質(zhì)健康子二代中華鱘30尾，體質(zhì)量為（2.45±0.14）kg，體長為（82.40±1.60）cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)在5個(gè)直徑4.0 m、水深0.8 m的實(shí)驗(yàn)池中進(jìn)行，亞硝酸鹽濃度設(shè)置為0.01 mg·L-1（對照組）、0.20 mg·L-1（低濃度組）、0.40 mg·L-1（中濃度組）、0.80 mg·L-1（中高濃度組）、1.60 mg·L-1（高濃度組），每個(gè)濃度組6尾魚。實(shí)驗(yàn)開始前，用120 mg·L-1MS-222將中華鱘進(jìn)行麻醉后稱重，并測其全長、體長，最后將其轉(zhuǎn)至實(shí)驗(yàn)池中暫養(yǎng)，3 d后開始實(shí)驗(yàn)。暫養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)期間，溶解氧6.1～7.2 mg·L-1，pH 7.3～7.6，氨氮濃度＜0.05 mg·L-1；暫養(yǎng)期間水溫（16.5±0.6）℃，實(shí)驗(yàn)期間水溫16.7～21.8℃。亞硝酸鹽濃度用10 g·L-1的NaNO2母液進(jìn)行調(diào)配，實(shí)驗(yàn)池水每24 h換一次；每天9∶00投喂一次，投喂量為魚體質(zhì)量的1%，攝食完成后及時(shí)清除殘餌，并觀察記錄魚的攝食及活動狀態(tài)；若出現(xiàn)試驗(yàn)魚死亡現(xiàn)象，及時(shí)記錄并采集其體質(zhì)量、全長和體長等生物學(xué)數(shù)據(jù)；實(shí)驗(yàn)持續(xù)60 d。

1.3 樣品的采集和處理

取樣前，用120 mg·L-1MS-222將實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行麻醉，然后抽血，3 500 r·min-1離心10 min，取上層血清保存于2 mL離心管中，經(jīng)液氮快速冷凍后，-70℃保存待測。將試驗(yàn)魚解剖，將內(nèi)臟團(tuán)和肝臟稱重，然后取肝臟并將其切成小塊，置于2 mL離心管中，經(jīng)液氮快速冷凍后，-70℃保存待測。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 生長指標(biāo)

計(jì)算成活率（SR）、增重率（WGR）、特定生長率（SGR）、肝體比（HSI）、肥滿度（CF）和臟體比（VSI），計(jì)算公式為：

式中，Nf為終末魚尾數(shù)；Ni為初始魚尾數(shù)；Wt為終末體質(zhì)量（g）；W0為初始體質(zhì)量（g）；t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)（d）；Wb為每尾魚體質(zhì)量（g）；L為每尾魚體長（cm）；Wh為肝臟質(zhì)量（g）；We為內(nèi)臟團(tuán)質(zhì)量（g）。

1.4.2 抗氧化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的測定

抗氧化指標(biāo)包括超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、總抗氧化能力（TAOC）活性、谷胱甘肽（GSH）含量、丙二醛（MDA）含量；免疫指標(biāo)包括溶菌酶（LZM）活性和免疫球蛋白M（IgM）含量。所有指標(biāo)的測定采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒，具體方法參見其說明書。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Spss16.0和Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan’s多重比較檢驗(yàn)慢性亞硝酸鹽脅迫對各項(xiàng)指標(biāo)影響的顯著性，差異的顯著性以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘存活及生長性能的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在持續(xù)60 d的慢性亞硝酸鹽脅迫中，對照組、低濃度組、中濃度組和中高濃度組試驗(yàn)魚的成活率為100%，但高濃度組試驗(yàn)魚出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡率為33.33%，死亡魚體特征為體表發(fā)白，黏液增多，口裂張開，吻端和肛門充血（圖1）。隨著亞硝酸鹽濃度的升高，子二代中華鱘的增重率和特定生長率呈逐漸降低的趨勢，中濃度組、中高濃度組和高濃度組與對照組均存在顯著性差異（P＜0.05）。在增重率方面，中濃度組、中高濃度組、高濃度組分別是對照組的54.85%、28.19%和12.77%；在特定生長率方面，中濃度組、中高濃度組、高濃度組分別是對照組的55.17%、31.03%和13.79%；此外，亞硝酸鹽濃度的升高對試驗(yàn)魚的肝體比、臟體比和肥滿度未產(chǎn)生顯著性的影響（P＞0.05）。

圖1 高濃度組死亡的子二代中華鱘Fig.1 Dead F2 Acipenser sinensis of high concentration group

表1 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘生長指標(biāo)的影響Tab.1 Effect of chronic nitrite stress on grow th index of F2 Acipenser sinensis

2.2 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘抗氧化指標(biāo)的影響

2.2.1 SOD活性

在慢性亞硝酸鹽脅迫條件下，各濃度組子二代中華鱘血清和肝臟SOD活力見圖2。隨著亞硝酸鹽濃度的升高，試驗(yàn)魚血清和肝臟SOD活性呈逐漸降低的趨勢。中濃度組、中高濃度組、高濃度組血清SOD活性顯著低于對照組（P＜0.05），較對照組分別下降21.81%、28.31%和34.06%；中高和高濃度組肝臟SOD活性也顯著低于對照組（P＜0.05），較對照組分別下降21.07%和23.35%。

2.2.2 CAT活性

子二代中華鱘血清和肝臟CAT活性變化如圖3所示。亞硝酸鹽濃度越大，試驗(yàn)魚血清和肝臟的CAT活性越小。對照組血清和肝臟CAT活性分別為1.20 U·mL-1和15.61 U·mg-1prot，其血清CAT活性分別是低濃度組、中濃度組、中高濃度組和高濃度組的1.19、1.40、1.72和2.09倍，其肝臟CAT活性分別是低濃度組、中濃度組、中高濃度組和高濃度組的1.09、1.14、1.16和1.55倍；其中，高濃度組與對照組之間存在顯著性差異（P＜0.05），其他各組之間差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘血清、肝臟SOD活力的影響Fig.2 Effect of chronic nitrite stress on SOD activity of F2 Acipenser sinensis

2.2.3 GSH含量

子二代中華鱘血清和肝臟GSH含量變化如圖4所示。各組試驗(yàn)魚血清和肝臟GSH含量由大到小依次為對照組、低濃度組、中濃度組、中高濃度組和高濃度組，其中，中濃度組、中高濃度組、高濃度組血清和肝臟GSH含量及低濃度組肝臟GSH含量均與對照組存在顯著差異（P＜0.05）。

圖3 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘血清、肝臟CAT活力的影響Fig.3 Effect of chronic nitrite stress on CAT activity of F2 Acipenser sinensis

圖4 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘血清、肝臟GSH含量的影響Fig.4 Effect of chronic nitrite stress on GSH content of F2 Acipenser sinensis

2.2.4 T-AOC活力

慢性亞硝酸鹽脅迫顯著降低了子二代中華鱘血清和肝臟T-AOC活性（圖5）。低濃度組、中濃度組、中高濃度和高濃度組血清T-AOC活性較對照組分別降低16.84%、26.83%、39.63%和52.14%，其中，中濃度組、中高濃度組、高濃度組與對照組存在顯著性差異（P＜0.05）；低濃度組、中濃度組、中高濃度組和高濃度組肝臟TAOC活性較對照組分別降低32.09%、46.31%、50.11%和59.69%，低濃度組、中濃度組、中高濃度組、高濃度組與對照組均存在顯著性差異（P＜0.05）。

圖5 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘血清、肝臟T-AOC活力的影響Fig.5 Effect of chronic nitrite stress on T-AOC activity of F2 Acipenser sinensis

2.2.5 MDA含量

隨著亞硝酸鹽濃度的增大，子二代中華鱘血清和肝臟MDA含量逐漸增加（圖6）。當(dāng)亞硝酸鹽濃度達(dá)到1.6 mg·L-1時(shí)，子二代中華鱘的血清和肝臟MDA含量分別升高至10.69 nmol·mL-1和11.03 nmol·mg-1prot，分別是對照組血清和肝臟MDA含量的1.99倍和1.56倍（P＜0.05）。此外，高濃度組血清MDA含量顯著高于低濃度組（P＜0.05），中濃度組和中高濃度組肝臟MDA含量與對照組均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘免疫指標(biāo)的影響

2.3.1 LZM活力

子二代中華鱘血清和肝臟LZM活性隨亞硝酸鹽濃度升高而顯著降低（圖7）。與對照組相比，高濃度組試驗(yàn)魚血清和肝臟LZM活性分別降低30.02%和48.40%，且兩組之間存在顯著性差異（P＜0.05）；中濃度組、中高濃度組、高濃度組肝臟LZM活性與對照組、低濃度組均存在顯著性差異（P＜0.05）。

圖6 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘血清、肝臟MDA含量的影響Fig.6 Effect of chronic nitrite stress on MDA content of F2 Acipenser sinensis

圖7 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘血清、肝臟LZM活力的影響Fig.7 Effect of chronic nitrite stress on LZM activity of F2 Acipenser sinensis

2.3.2 IgM含量

子二代中華鱘血清和肝臟IgM含量變化情況見圖8。各組試驗(yàn)魚血清和肝臟IgM含量依次表現(xiàn)為對照組＞低濃度組＞中濃度組＞中高濃度組＞高濃度組，中濃度組、中高濃度組、高濃度組血清IgM含量顯著低于對照組（P＜0.05），較對照組分別降低22.54%、29.07%和40.91%。中高濃度組和高濃度組肝臟IgM含量顯著低于對照組（P＜0.05），較對照組分別降低26.26%和41.54%。

圖8 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘血清和肝臟IgM含量的影響Fig.8 Effect of chronic nitrite stress on IgM content of F2 Acipenser sinensis

3 討論

3.1 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘生長性能的影響

養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度的高低是評價(jià)其水質(zhì)好壞的重要指標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn)，水體中亞硝酸鹽濃度的升高會對魚類的行為產(chǎn)生一定影響，如呼吸頻率增加、游動變緩、攝食頻率下降［15-16］，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與之相同。此外，慢性亞硝酸鹽脅迫還造成了子二代中華鱘的死亡，高濃度組試驗(yàn)魚的成活率僅為66.67%，試驗(yàn)魚死后其鰓蓋和口裂多呈張開狀態(tài)，原因可能為亞硝酸鹽脅迫導(dǎo)致魚體血液紅細(xì)胞皺縮、變形、破裂［17］，紅細(xì)胞和血紅蛋白的數(shù)量下降［18］，高鐵血紅蛋白數(shù)量急劇升高，從而導(dǎo)致魚體死于氧缺乏癥［19］。

大量研究表明，慢性亞硝酸鹽脅迫對魚類的生長會產(chǎn)生顯著的抑制作用，如斑點(diǎn)叉尾鮰［20］（Ietalurus punetaus）、澳 洲 銀 鱸［21］（Bidyanus bidyanus）、吉富羅非魚［22］（Oreochromis niloticus）等，本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相同。本研究中，隨著亞硝酸鹽濃度的增加，子二代中華鱘的增重率和特定生長率呈逐漸降低的趨勢，這可能是由兩方面的原因造成的，一是亞硝酸鹽脅迫會導(dǎo)致魚類的食欲下降，降低其攝食率和飼料轉(zhuǎn)化率，從而引起魚體生長速率下降；二是亞硝酸鹽導(dǎo)致魚體處于應(yīng)激狀態(tài)，血液的攜氧能力下降，機(jī)體組織缺氧，魚體消耗大量糖類、脂肪、蛋白質(zhì)來為抵御應(yīng)激提供能量，減少了用于生長的能量分配［4，16，22-23］。但SIIKAVUOPIA和SATHER［24］將大西洋鱈（Gadusmorhua）置于1.0、2.5、5.0 mg·L-1的亞硝酸鹽溶液中脅迫93 d后，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)魚的平均體質(zhì)量顯著低于對照組，但餌料系數(shù)、攝食率與對照組之間沒有顯著性差異，這可能與魚的種類、規(guī)格及脅迫程度有關(guān)。

3.2 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘抗氧化指標(biāo)的影響

亞硝酸鹽脅迫會導(dǎo)致魚體產(chǎn)生大量自由基（ROS），對重要的組織器官造成損傷［16，25］。生物體內(nèi)存在可清除過多活性氧ROS的抗氧化防御體系，主要包括抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)，其中，超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）就是抗氧化防御體系中非常重要的功能酶［26］，二者相互關(guān)聯(lián)，可聯(lián)合清除ROS，其活性的下降標(biāo)志著機(jī)體清除ROS的能力下降［27］。本研究中，慢性亞硝酸鹽脅迫顯著降低了子二代中華鱘肝臟SOD和CAT活性，這與鯽［3］（Carassius auratus）、鯉［28］（Cyprinus carpio）和紅鰭東方鲀［29］（Takifugu rubripes）的研究結(jié)果相同，其原因可能與亞硝酸鹽脅迫導(dǎo)致酶合成途徑受阻有關(guān)［30］。

谷胱甘肽（GSH）是一種低分子ROS清除劑［31］，是清除ROS非常重要的非酶抗氧化物質(zhì)［32］，而丙二醛（MDA）是ROS與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，它可以反映細(xì)胞受ROS攻擊的程度，從而間接反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱及組織細(xì)胞受損傷的嚴(yán)重程度［31，33］。本研究中，慢性亞硝酸鹽脅迫顯著降低了子二代中華鱘血清和肝臟的GSH含量，GSH的消耗主要與GSH作為谷胱甘肽過氧化酶（GPX）的底物參與清除過氧化氫的解毒途徑有關(guān)，還與其直接參與高鐵血紅蛋白的還原過程有關(guān)［34］。此外，子二代中華鱘血清和肝臟MDA含量隨亞硝酸鹽濃度的升高而顯著增加，其原因主要是魚體抗氧化防御體系不能消除體內(nèi)過多的ROS，導(dǎo)致其與細(xì)胞發(fā)生大量脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而使得MDA在魚體中大量積累。

總抗氧化能力（T-AOC）的大小是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能的綜合性指標(biāo)，它可以反映機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)應(yīng)對外來脅迫的能力［35］。本實(shí)驗(yàn)中，隨著亞硝酸鹽濃度的升高，子二代中華鱘血清和肝臟T-AOC活性顯著降低，這與譚樹華等［3］和汪家鑫等［29］的研究結(jié)果一致。然而也有研究得出不同結(jié)論，吳寧［34］研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)14 d的亞硝酸鹽脅迫導(dǎo)致團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）抗氧化酶活性顯著升高，這主要是由于魚類對亞硝酸鹽脅迫的生理響應(yīng)與脅迫時(shí)間、暴露濃度及溶氧水平等密切相關(guān)［3，15，34］。

3.3 慢性亞硝酸鹽脅迫對子二代中華鱘免疫指標(biāo)的影響

溶菌酶（LZM）和免疫球蛋白M（IgM）是魚體非常重要的免疫因子，前者可以破壞革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，從而瓦解細(xì)菌細(xì)胞［36］；后者具有強(qiáng)大的抗感染作用。葛紅星等［37］研究認(rèn)為，亞硝酸鹽慢性脅迫顯著降低了凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的免疫力，增加了其對副溶血弧菌的易感性；孟順龍等［38］、陳家長等［39］研究發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽可顯著降低羅非魚（GIFTOreochromis niloticus）的溶菌酶活性，導(dǎo)致其機(jī)體免疫力下降，對海豚鏈球菌的易感性增加，且死亡率和暴露時(shí)間呈顯著正相關(guān)；葛立安等［40］也發(fā)現(xiàn)，在受到0.32 mg·L-1亞硝酸鹽脅迫15 d后，異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）血清溶菌酶活性、巨噬細(xì)胞吞噬活性等顯著下降，本研究的結(jié)果與之基本一致。本研究中，隨著亞硝酸鹽脅迫濃度的升高，子二代中華鱘血清和肝臟LZM活性及IgM含量均表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢。這表明慢性亞硝酸鹽脅迫降低了魚體溶菌酶的活性及IgM的合成，對魚體的免疫功能產(chǎn)生了顯著的抑制作用，降低了魚體的免疫力，其原因可能為魚類受環(huán)境脅迫作用時(shí)，大量免疫抑制因子會在外圍淋巴組織中產(chǎn)生，并逐漸被釋放到血液中，從而影響巨噬、淋巴細(xì)胞的含量及活性，進(jìn)而抑制免疫應(yīng)答［41］。

4 小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)60 d的慢性亞硝酸鹽脅迫導(dǎo)致子二代中華鱘的特定生長率和增重率顯著下降，肝臟SOD活性、CAT活性、T-AOC活性、LZM活性、GSH含量及IgM含量顯著下降，MDA含量顯著升高，這表明慢性亞硝酸鹽脅迫對中華鱘的生長、抗氧化能力和免疫能力產(chǎn)生了顯著的不利影響。當(dāng)亞硝酸鹽濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，中華鱘的增重率、特定生長率與對照組相比均無顯著性變化，其全部血清抗氧化、免疫指標(biāo)及肝臟SOD活性、CAT活性、LZM活性、MDA含量、IgM含量等指標(biāo)與對照組相比也均未出現(xiàn)顯著性變化；而當(dāng)亞硝酸鹽濃度＞0.2 mg·L-1時(shí)，中華鱘的增重率、特定生長率均顯著低于對照組，其血清SOD活性、T-AOC活性、GSH含量、IgM含量及肝臟T-AOC活性、LZM活性、GSH含量、MDA含量等指標(biāo)也均顯著低于對照組，這表明當(dāng)亞硝酸鹽濃度≤0.2 mg·L-1時(shí)，亞硝酸鹽脅迫對中華鱘生長、抗氧化及免疫指標(biāo)基本無實(shí)質(zhì)影響，但當(dāng)亞硝酸鹽濃度＞0.2 mg·L-1時(shí)，亞硝酸鹽脅迫已對中華鱘血清、肝臟的抗氧化及免疫指標(biāo)造成了顯著的不利影響。所以，在中華鱘的日常養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度應(yīng)至少≤0.2 mg·L-1，以避免其對中華鱘造成損傷。