朱之發(fā)，邊 力，王亞美，陳四清，楊珍珍，李鳳輝

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；4.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東青島 266071）

在海洋資源逐年下降的情況下，開發(fā)新的海洋物種養(yǎng)殖尤為重要。開展新物種養(yǎng)殖首要任務(wù)是實現(xiàn)人工繁育，需了解該物種的繁殖特點，從而掌握繁殖的時間和環(huán)境條件。促性腺激素釋放激素（GnRH）是由下丘腦分泌的十肽激素，是動物生殖過程中的關(guān)鍵激素之一。1971年，BABA等［1］和AMOSS等［2］首先從下丘腦分離出GnRH。在脊椎動物中，GnRH是下丘腦-垂體-性腺生殖軸（HPG）的關(guān)鍵神經(jīng)肽，是生殖功能調(diào)節(jié)的核心。哺乳動物GnRH最初是從豬和羊的大腦中分離出［1，3］，在非哺乳脊椎動物中，又分離出13種GnRH分子形式［4-6］。無脊椎動物中的GnRH最初是使用哺乳動物和雞的GnRH抗血清，通過異源免疫組化技術(shù)獲得的［7-11］。盡管在無脊椎動物中缺乏GnRH的分子特征，但在章魚（頭足綱八腕目）神經(jīng)系統(tǒng)檢測到雞的GnRH-I免疫反應(yīng)［10-11］。目前已從真蛸的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離出具有脊椎動物GnRHs結(jié)構(gòu)的神經(jīng)肽，克隆到編碼受體蛋白的cDNA，命名為oct-GnRH，屬于GnRH神經(jīng)肽家族［12］。但對于長蛸oct-GnRH基因克隆及其特異性表達尚未見相關(guān)報道。

長蛸俗稱大蛸、長腿蛸等，屬于八腕目（Octopoda），蛸科（Octopodidae），蛸屬，分布于韓國、中國、日本和俄羅斯庫頁島沿海水域［13-14］，喜穴居，肉質(zhì)鮮嫩，蛋白質(zhì)豐富且營養(yǎng)均衡［15］，可食用部分占身體的90%以上，可加工成干制品，食用方式多樣［8］，是我國沿海重要的經(jīng)濟蛸類［16］。長蛸作為重要的經(jīng)濟物種，近年來我國開始對其進行人工養(yǎng)殖研究，但目前對于長蛸的繁育機制尚未完全了解，處于探究階段，導(dǎo)致長蛸的工廠化養(yǎng)殖與苗種繁育較為困難。GnRH是控制章魚生殖的關(guān)鍵神經(jīng)肽［12］，因此開展GnRH基因和表達的研究，可為長蛸人工養(yǎng)殖與苗種繁育提供理論支持。本研究運用cDNA末端快速擴增和實時熒光定量PCR技術(shù)，獲得oct-GnRH基因cDNA的序列，分析GnRH基因在長蛸體內(nèi)各器官的表達水平，旨在完善長蛸的分子與生殖生物學(xué)信息，為研究長蛸腦部結(jié)構(gòu)功能及生殖相關(guān)神經(jīng)肽的分泌特征提供數(shù)據(jù)支持，為實現(xiàn)長蛸工廠化繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織樣品制備

取性成熟長蛸，觀察其右邊第3條腕，確定其性別，雄性長蛸和雌性長蛸各取3尾，體質(zhì)量為152～189 g，解剖后分別取食道上神經(jīng)團、食道下神經(jīng)團、視葉區(qū)、吸盤、腕肌肉、軸神經(jīng)索、視網(wǎng)膜、心臟、腎臟、肝胰臟、鰓、前唾液腺、后唾液腺、卵巢、纏卵腺、精巢、精頰囊、前列腺、食道、胃、胃盲囊、腸、胴部肌肉、皮膚，立即放入含有RNA保存液的2.0 mL離心管中，液氮速凍后，將樣品保存于-80℃超低溫冰箱，待用。

1.2 試劑與試劑盒

PremixTaqTM（TaKaRaTaqTMVersion 2.0）、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株感受態(tài)細胞、pMDTM18-T Vector試劑盒、RACE試劑盒（SMARTTMRACE cDNA Amplification RACE）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）、DNA凝膠回收試劑盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）和SYBR?Premix ExTaqTM購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

本研究采用Trizol法分別提取雌雄長蛸各組織的總RNA，取2μL總RNA用于1.0%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性，取1 μL總RNA用于紫外分光光度計（NanoDrop 2 000 Thermo Scientific，USA）檢測所提取RNA的純度及濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，利用RACE試劑盒分別合成5′與3′RACE cDNA模板，所有操作根據(jù)試劑盒說明書進行。

1.4 GnRH基因核心序列克隆

根據(jù)長蛸已知的GnRH保守序列和NCBI GenBank中真蛸GnRH基因（GenBank登錄號：AB037165），通過Primer 5.0設(shè)計引物GnRH F1和GnRH R1（表1），以食道下神經(jīng)團組織的cDNA為模板擴增核心序列。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：PremixTaqTM10μL、GnRH F1（10 μmol·L-1）0.5μL、GnRH R1（10μmol·L-1）0.5μL、cDNA（1μg·μL-1）1μL及ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃60 s，35個循環(huán)；72℃10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測，在DUT-48超薄型紫外切膠儀中切膠，經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收純化，克隆到pMD18-T Vector中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中過夜培養(yǎng)。挑取陽性單克隆，經(jīng)菌落PCR鑒定，篩選目的菌液送至華大基因公司測序。

1.5 GnRH基因全長克隆

根據(jù)測序所得核心序列設(shè)計特異性引物3′RACE 1、5′RACE 1、3′RACE 2與5′RACE 2，通過巢式PCR進行3′和5′端RACE擴增。3′端擴增：以3′RACE cDNA為模板，分別加入接頭引物UPM與引物3′RACE 1組合、接頭引物NUP與引物3′RACE 2組合擴增3′端基因序列；5′端擴增：分別加入接頭引物UPM與引物5′RACE 1組合、接頭引物NUP與引物5′RACE 2組合擴增5′端基因序列。

PCR反應(yīng)體系（20μL）：PremixTaqTM10μL、3′或5′特異性引物0.5μL、UPM或NUP 0.5μL、RACE-cDNA 1μL及ddH2O 8μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30 s，60℃30 s，72℃60 s，35個循環(huán)；72℃10 min。將PCR產(chǎn)物進行檢測、膠回收、純化、連接與轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。挑取陽性單克隆，經(jīng)菌落PCR鑒定后送至華大基因公司測序。

1.6 GnRH基因序列分析

使用軟件Contig Express軟件對GnRH基因的測序結(jié)果進行拼接、驗證，利用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi）預(yù)測GnRH基因的開放閱讀框。利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）、SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）、Signal 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線生物學(xué)軟件分析GnRH編碼蛋白的基本物理性質(zhì)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域。用NCBI搜索同源蛋白序列，并使用軟件DNAMAN對其進行蛋白序列的多重比較，利 用MEGA5.2［12］軟 件，采 用 鄰 接 法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.7 實時熒光定量PCR

根據(jù)GnRH基因的核心序列，通過Primer5.0設(shè)計熒光定量特異性引物GnRH F/R，β-actin F/R作為內(nèi)參，以長蛸不同組織的cDNA為模板，使用Mastercycler epgradient S realplex4實時熒光定量PCR儀（Eppendorf，德國），采用2-ΔΔCt的計算方法分析GnRH基因的相對表達量。20μL反應(yīng)體系：SYBR?Premix ExTaqTM（2x）10μL、ROX Reference Dye II（50x）0.4μL、GnRH F（10μmol·L-1）0.4μL、GnRH F（10μmol·L-1）0.4 μL、cDNA（50ng·μL-1）2μL及ddH2O 6.8μL，反應(yīng)程序：95℃5 min；95℃15 s，60℃30 s，40個循環(huán)；95℃15 s；60℃60 s；95℃15 s。

數(shù)據(jù)處理為GnRH基因相對表達量的平均值±標準差（Mean±SD），生物學(xué)重復(fù)n=3。使用SPSS22.0軟件對實時熒光定量PCR結(jié)果進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan多重比較，P＜0.05表示差異顯著，并用Excel2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 oct-GnRH基因序列分析

長蛸oct-GnRH基因全長853 bp，命名為oct-GnRH，開放閱讀框（ORF）長270 bp，編碼89個氨基酸。5′-UTR和3′-UTR分別長153 bp和430 bp。經(jīng)過ExPASy、SMART、Signal4.1和NCBI在線生物學(xué)軟件分析，推斷oct-GnRH的89個氨基酸分子量為9 989.51Da，理論等電點為7.77，7個負電荷殘基，8個正電殘基，1個跨膜結(jié)構(gòu)處于13～32位編碼20個氨基酸，1個信號肽處于1～31位編碼31個氨基酸，2個結(jié)構(gòu)域分別為7～86位編碼80個氨基酸的BEN結(jié)構(gòu)域和45～77位編碼33個氨基酸的Pox-A3L結(jié)構(gòu)域（圖1）。

表1 GnRH基因的克隆及表達分析所用引物Tab.1 Primers used in cloning and characterizing the GnRH gene

2.2 氨基酸序列種間比對

在NCBI中，將本研究的長蛸oct-GnRH氨基酸序列與其他物種的GnRH基因編碼的氨基酸序列進行比對，結(jié)果顯示，該氨基酸序列與真蛸（Octopus valgaris）相似度最高（96.63%），其次是曼氏無針烏賊（Sepiella japonica）（74.16%）和劍尖槍烏賊（Uroteuthis edulis）（70.79%）。其他物種相似度較低：菲律賓簾蛤（Ruditapes philippinarum）（44.83%）、法螺（Charonia tritonis）（34.25%）、網(wǎng)紋野蛞蝓（Deroceras reticulatum）（31.03%）、澳大利亞綠邊鮑魚（Haliotis laevigata）（45.28%）、皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）（45.28%）、蝦 夷 扇 貝（Mizuhopecten yessoensis）（40.32%）、鴨 嘴 海 豆 芽（Lingula anatina）（31.88%）、海蛞蝓（Aplysia californica）（31.36%）、耳鮑（Haliotis asinina）（35.23%）。利用DNAMAN軟件對不同物種的氨基酸序列（表2）進行比對，結(jié)果顯示（圖2），包括長蛸在內(nèi)的頭足類均含有保守的BEN結(jié)構(gòu)域和Pox-A3L結(jié)構(gòu)域。

圖1 長蛸oct-GnRH基因cDNA序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced am ino acid sequences of oct-GnRH gene of Octopusm inor

圖2 長蛸oct-GnRH氨基酸序列的物種間比對Fig.2 M u ltip le alignments of oct-GnRH am ino acid sequences of Octopusm inor between species

2.3 系統(tǒng)進化樹

利用MEGA 5.2軟件對oct-GnRH基因編碼的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析。所選物種（表2）包括真蛸、曼氏無針烏賊、劍尖槍烏賊、菲律賓簾蛤、法螺、網(wǎng)紋野蛞蝓、澳大利亞綠邊鮑魚、皺紋盤鮑、蝦夷扇貝、海蛞蝓、耳鮑、鴨嘴海豆芽。結(jié)果顯示（圖3），長蛸與同為蛸屬的真蛸進化上關(guān)系最近，其次是同為頭足綱烏賊目的曼氏無針烏賊與劍尖槍烏賊，隨后是軟體動物門中的腹足綱與瓣鰓綱等；腕足動物門無鉸綱無穴目海豆芽科的鴨嘴海豆芽與長蛸的進化關(guān)系最遠。

表2 物種GnRH氨基酸序列登錄號Tab.2 Sequence ID of species GnRH am ino acid sequence

2.4 長蛸GnRH基因組織特異性表達

利用β-actin和oct-GnRH正反引物在聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）下檢測oct-GnRH基因在長蛸24個組織中是否表達。結(jié)果表明，食道上神經(jīng)團、食道下神經(jīng)團、視葉、腕肌肉、軸神經(jīng)索、腎臟、肝胰臟、后唾液腺、卵巢、纏卵腺、精巢、精頰囊、前列腺、食道、胃、胃盲囊、腸和胴部肌肉18個組織中有oct-GnRH基因的表達，吸盤、視網(wǎng)膜、心臟、鰓、前唾液腺和皮膚6個組織中無GnRH基因的表達。運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測oct-GnRH基因在長蛸18個組織（有oct-GnRH基因表達）的表達水平。圖4～圖6顯示，在長蛸的雌雄個體中oct-GnRH基因在食道上神經(jīng)團和食道下神經(jīng)團表達量較高，其中食道下神經(jīng)團表達量最高，雌性個體的表達量要顯著高于雄性個體。在剩余組織中，雄性的視葉、腕肌肉、軸神經(jīng)索、肝胰臟、精巢和雌性的視葉、腕肌肉和軸神經(jīng)索含量較高，剩余組織表達量較低。表明oct-GnRH主要的表達位置為神經(jīng)系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達量最高，腕部肌肉和肝胰臟的表達量較高。腕部肌肉中oct-GnRH的表達量較高原因與腕部含有大量的神經(jīng)節(jié)有關(guān)［17］，肝胰臟中oct-GnRH的表達量較高可能與肝胰臟的體積大且是主要的代謝器官有關(guān)。

圖3 長蛸與其他物種基于GnRH氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of GnRH am ino acid sequences from Octopusm inor and other vertebrates

圖4 oct-GnRH基因在雄性長蛸組織器官中的相對表達量Fig.4 Relative exp ression of oct-GnRH gene in tissues ofmale Octopusminor

圖5 oct-GnRH基因在雌性長蛸組織器官中的相對表達量Fig.5 Relative expression of oct-GnRH gene in tissues of female Octopusm inor

圖6 oct-GnRH基因在雌雄長蛸食道上神經(jīng)團與食道下神經(jīng)團中的相對表達量Fig.6 Relative expression of oct-GnRH gene in the supraesophagealmass and subesophagealmass of Octopusminor

3 討論

某些章魚（頭足綱八腕目）體內(nèi)的十二肽GnRH（oct-GnRH）是促性腺激素釋放激素神經(jīng)肽家族的成員［18］，脊椎動物的GnRH是十肽結(jié)構(gòu)，oct-GnRH氨基酸結(jié)構(gòu)中多了-Asn2-Tyr3-殘基［12］。oct-GnRH前體蛋白的結(jié)構(gòu)與脊椎動物的GnRH相似，由信號肽、肽激素序列、-Gly-Lys-Arg序列和GnRH相關(guān)蛋白（GAP）序列組成［12］。近幾年對多種無脊椎動物的GnRH同源基因研究表明oct-GnRH神經(jīng)肽的存在［19-20］。在軟體動物中，頭足綱3個物種［12，21-22］、瓣鰓綱2個物種［23-24］和腹足綱2個物種［19，25］中已發(fā)現(xiàn)oct-GnRH。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中存在具有GnRH和昆蟲脂肪代謝激素結(jié)構(gòu)的肽（GnRH-AKH）［26］，推測有GnRH神經(jīng)肽超家族的存在［20］。GnRH在脊椎動物的大腦中分布廣泛，參與多種生理功能（行為、代謝和免疫）的調(diào)控［27］。oct-GnRH在章魚腦內(nèi)神經(jīng)纖維中被大量檢測到，表明oct-GnRH對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)傳遞和神經(jīng)調(diào)節(jié)起作用，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制進食順序［28］、觸覺和視覺記憶系統(tǒng)［29］、其他器官系統(tǒng)和行為［30］。

本研究首次獲得長蛸的oct-GnRH基因，cDNA全長為853 bp，開放閱讀框為270 bp，5′非編碼區(qū)為153 bp，3′非編碼區(qū)430 bp。長蛸oct-GnRH編碼的89個氨基酸分子量為9 989.51Da，理論等電點為7.77，7個負電荷殘基，8個正電殘基，1個跨膜結(jié)構(gòu)處于13～32位編碼20個氨基酸，1個信號肽處于1～31位編碼31個氨基酸，2個結(jié)構(gòu)域分別為7～86位編碼80個氨基酸的BEN結(jié)構(gòu)域和45～77位編碼33個氨基酸的Pox-A3L結(jié)構(gòu)域。從劍尖槍烏賊的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）克隆的cDNA的開放閱讀框在核苷酸序列上與長蛸的oct-GnRH相似，約為80.5%［26］。曼氏無針烏賊和劍尖槍烏賊GnRH的氨基酸序列與長蛸的oct-GnRH相同。本研究中長蛸的oct-GnRH基因編碼的氨基酸序列與真蛸相似度最高（96.63%），其次是曼氏無針烏賊（74.16%）和劍尖槍烏賊（70.79%），都含有BEN結(jié)構(gòu)域和Pox-A3L結(jié)構(gòu)域，表明頭足類的oct-GnRH具有高度相似性。

長蛸oct-GnRH基因的實時熒光定量PCR結(jié)果表明，oct-GnRH基因的表達量在雌雄個體食道上神經(jīng)團和食道下神經(jīng)團中差異較小，oct-GnRH基因主要表達位置為神經(jīng)系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達量最高，其次是腕部肌肉和肝胰臟的表達量較高。而軟體動物中對GnRH相關(guān)功能研究較少，主要對脊椎動物GnRH亞型進行研究［20，31-36］。目前，已經(jīng)在少數(shù)物種上進行了基于同源GnRH的生理學(xué)研究。在真蛸中，oct-GnRH刺激輸卵管收縮和性腺類固醇合成，在生殖過程中起作用［37-38］。然 而，在加利 福尼 亞 海兔（Aplysia californica）中，同源的GnRH能調(diào)節(jié)多種中樞神經(jīng)元的活性并抑制袋狀細胞放電，但對生殖無影響［39-40］。將oct-GnRH注 射 到 加 州 雙 斑 蛸（Octopus bimaculoides）幼體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)附近的血竇中，會導(dǎo)致運動異常（爬行搖晃和腕部扭曲）及外套膜、心臟和色素體的過度活躍，表明oct-GnRH參與神經(jīng)葉的神經(jīng)傳遞與調(diào)節(jié)。在真蛸的腦亞腳葉、嗅葉、視腺和視腺神經(jīng)中檢測到oct-GnRH，表明oct-GnRH參與控制視腺的活動：生殖細胞的增殖、性腺的成熟和卵黃蛋白的合成［41］。oct-GnRH在日本鵪鶉（Coturnix coturnix）的垂體前葉細胞中顯示出促黃體生成激素的活性［12］。oct-GnRH促進卵巢和精巢中雄性激素、孕酮和17β-雌二醇（E2）的基礎(chǔ)類固醇合成［38］，活性與GnRH在脊椎動物生殖系統(tǒng)中的活性相似［42］，oct-GnRH存在于含有精子的組織中［37］，表明oct-GnRH可能通過孕酮合成促進精子的預(yù)活化。oct-GnRH存在于視葉叢狀層中，表明oct-GnRH參與視覺輸入對視神經(jīng)的調(diào)控［37］。本研究結(jié)果也顯示，oct-GnRH主要表達于神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)纖維所控制的部分組織，與多種生理功能相關(guān)。

oct-GnRH可能是腦腳亞葉或嗅葉-視腺-性腺軸中的關(guān)鍵肽，作用類似于脊椎動物體內(nèi)在下丘腦-垂體-性腺-性腺軸的GnRH［37］。視腺中的oct-GnRH或未發(fā)現(xiàn)的促性腺激素可能釋放到血液中并作用于性腺，通過oct-GnRH的受體調(diào)節(jié)性類固醇來誘導(dǎo)性成熟和產(chǎn)卵［38，43］。除了促進生殖作用外，oct-GnRH是一種具有多種功能的肽，并具有許多重要的生理作用，包括進食、記憶、運動和自主功能［37］。因此，從分子層面研究長蛸的oct-GnRH的結(jié)構(gòu)、表達特點及在生殖發(fā)育中的作用，可為了解長蛸生殖發(fā)育中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與神經(jīng)肽調(diào)節(jié)機制提供直接數(shù)據(jù)，最重要的是為實現(xiàn)長蛸的工廠化養(yǎng)殖與苗種繁育技術(shù)的探索提供理論支持和數(shù)據(jù)參考。