曹洋銘，王叢叢，2，3，徐 豪，劉 洋，2，3

（1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點實驗室，上海 201306；3.國家遠洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

鰹（Katsuwonus pelamis），屬 鱸 形 目（Perciformes），鯖 亞 目（Scombroidei），鯖 科（Scombridae），鰹屬，是一種高度洄游的物種，廣泛分布于赤道至溫帶地區(qū)［1］，是世界金槍魚漁業(yè)重要的捕撈對象之一，其中中西太平洋金槍魚漁場是我國捕撈鰹最為重要的漁場。鰹作為世界上總累計產(chǎn)量最高的金槍魚，目前其年產(chǎn)量仍呈現(xiàn)上升趨勢［2］。當(dāng)前基于種群資源的評估中鰹雖然未出現(xiàn)過度捕撈，但捕撈量已經(jīng)接近完全開發(fā)狀態(tài)［3-4］。事實上，中西太平洋、大西洋的大眼金槍魚（Thunnus obesus）以及印度洋的黃鰭金槍魚（T.albacores）都正處在不同程度的過度捕撈狀態(tài)。為了避免鰹因不合理的開發(fā)而出現(xiàn)過度捕撈現(xiàn)象，對其資源群體進行準(zhǔn)確劃分和評估至關(guān)重要。近年來除了利用生物學(xué)特征來識別和區(qū)分鰹群體外，最常用的方法是群體遺傳研究，其中分子標(biāo)記被廣泛地應(yīng)用于海洋生物的群體遺傳學(xué)研究［5-6］。

物種的遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)反映了物種對不同環(huán)境條件的適應(yīng)性和可持續(xù)開發(fā)的潛力［7］，進行魚類遺傳多樣性及種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究對漁業(yè)資源有效管理和充分開發(fā)利用及保護極為重要。目前，有關(guān)中西太平洋鰹遺傳多樣性的研究較少，僅有陳瑩［8］等對中西太平洋相距較近的區(qū)域間鰹遺傳多樣性進行了研究。同時單一的基因標(biāo)記已經(jīng)無法滿足物種遺傳多樣性的研究，為此本實驗選取進化速率適中的線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）［9］基因和細胞色素b基因（Cytb）［10］這兩種分子標(biāo)記來分析中西太平洋鰹的群體遺傳結(jié)構(gòu)，以期為鰹漁業(yè)資源的管理和可持續(xù)開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和DNA提取

鰹樣本采自于中國中水集團遠洋股份有限公司，樣本采集區(qū)域、數(shù)量與時間如表1所示，采集的樣本取其背部肌肉，并利用標(biāo)準(zhǔn)酚氯仿抽提法提取基因組DNA［11］，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴增及序列測定

反應(yīng)體系25μL，其中1μL的DNA模板、5XPS 5μL、PrimerSTAR MAX 0.5μL、dNTPs 2 μL、上下游引物各0.5μL、雙蒸水16μL。PCR擴增引物序列根據(jù)軟件Primer5.0設(shè)計，參考序列為NCBI鰹線粒體DNA全序列GI：40804664，由生工生物工程（上海）有限公司合成，具體引物序列如表2所示。

擴增Cytb與COⅠ序列的反應(yīng)條件均為95℃2 min；95℃60 s；50℃30 s；72℃90s；30個循環(huán)；72℃5min。擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由生工生物工程（上海）有限公司進行序列測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

Cytb與COⅠ基因測序后的序列在MEGA 7.0［12］軟件中選用Clustal W進行序列比對。通過軟件DnaSP6.12［13］分析核苷酸組成、單倍型數(shù)（H）、單倍型多樣性指數(shù)（Hd）、核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）和基因流（Nm）。利用Network 4.0［14］軟件制作基于兩條基因序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，Arlepuin3.5.2.軟件［15］中的AMOVA分析計算Fst值并評估種群的遺傳多樣性水平。采用Tajima’sD［16］、Fu’sF［17］中性檢驗和核苷酸不對稱分布方法對種群歷史動態(tài)進行分析。最后利用公式T=t×Tau/4kμ［17］計算種群的擴張時間（其中t為研究對象的生殖周期，Tau為擴張時間參數(shù)，k為本文中分析序列的堿基數(shù)，μ為對應(yīng)基因序列每一代的進化速率）。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

經(jīng)過ClustalW序列比對獲得112條長度為1 059 bp的鰹Cytb基因序列，包含98個單倍型。其中88個單倍型分別只存在于3個群體中的某一個，所占總頻率為0.897 9。在分析的Cytb基因序列中，檢測到196個多態(tài)性位點，其中包含130個單一突變位點和66個簡約信息位點。另外，C、T、A、G 4種堿基的比例分別為39.5%、24.6%、25.5%、10.4%。

鰹COⅠ基因序列分析長度為1 205 bp，在這106條COⅠ序列中共存在52個單倍型，其中31個單倍型分別只存在于3個群體中的某一個群體，所占總頻率為0.596 2，遠遠低于Cytb序列。在COⅠ基因分析片段中，檢測到62個多態(tài)性位點，其中包含26個單一突變位點和36個簡約信息位點。另外，C、T、A、G 4種堿基的比例分別為35.2%、29.6%、28.3%、6.9%。鰹的Cytb和COⅠ基因序列中G的含量分別為10.4%、6.9%，核苷酸的組成明顯偏離G。

表1 樣本采集區(qū)域與數(shù)量Tab.1 Location and number of sam ples

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

2.2 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析結(jié)果如表3所示，3個區(qū)域群體的單倍型多樣性指數(shù)（Hd）均較高，但核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）均較低。在Cytb序列的分析中，Region2群體的Hd（0.995）略高于Region1（0.986）和Region3（0.993），Region2群體的Pi（0.012 0）略高于Region1（0.008 0）和Region3（0.008 0）。而在COⅠ的遺傳多樣性分析中，Region2群體的Hd（0.937）略低于Region1（0.953）和Region3（0.975），Region2群體的Pi（0.002 57）略低于Region1（0.002 74）和Region3（0.002 90）。

Fst值可用來估計亞種群間遺傳分化，簡而言之可用來衡量整個種群內(nèi)亞種群之間的近交程度。如表4所示，在Cytb序列的分析中，F(xiàn)st值均小于0.05，P值均大于0.05，且基因流Nm遠大于1，則可認為3個群體間不存在遺傳分化［18-19］?；贑OⅠ序列的分析結(jié)果與Cytb序列的分析結(jié)果一致。

2.3 鰹歷史種群動態(tài)

Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗在研究中被用來進行鰹的歷史種群動態(tài)分析。如表5所示，基于Cytb基因序列的分析顯示，所有群體的Tajima’sD和Fu’sFs均為負數(shù)，但Region 1區(qū)域群體的Tajima’sD值不存在顯著差異（P＞0.05），F(xiàn)u’sFs值在所有區(qū)域均存在極顯著性差異（P＜0.01）。負的Fs值和差異顯著的P值表示群體經(jīng)歷過擴張，從理論上說，F(xiàn)u’sFs方法檢測效果要比Tajima好，因此，可以認為3個區(qū)域群體在歷史上經(jīng)歷了種群擴張事件。而基于COⅠ基因序列的分析結(jié)果顯示，所有群體的Tajima’sD和Fu’sFs也均為負數(shù)，且在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著差異，兩者結(jié)果一致。根據(jù)兩段基因序列的核苷酸不配對分布分析顯示（圖1，圖2），所有核苷酸錯配分布曲線均呈現(xiàn)明顯單峰，說明鰹群體在歷史上經(jīng)歷了種群擴張事件，這與中性檢驗的結(jié)果相一致。

在種群擴張模型中對3個群體的平均Raggedness index進行計算，發(fā)現(xiàn)其P值均無顯著性差異，表示這個數(shù)據(jù)適合于種群擴張模型。通過Arlepuin 3.5.2.2軟件計算得到基于Cytb基因序列的鰹群體的Tau為6.682 93，Cytb基因的進化速率為（2%）/百萬年［20-22］，根據(jù)公式T=t×Tau/4kμ，進一步推算群體擴張時間，得到鰹群體擴張大概發(fā)生在7.88萬年前。同樣的，基于COⅠ基因序列計算得到的Tau為3.253 67，COⅠ基因的進化速率為（1%～3%）/百萬年［23］，推測鰹群體擴張大概發(fā)生在6.74萬年～2.25萬年前。

表3 基于Cytb和COⅠ序列的鰹遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of Cytb and COⅠgene sequences in Katsuwonus pelam is

表4 基于Cytb、COⅠ基因的鰹群體間的F st值（對角線下方）和基因流值（N m）（對角線上方）Tab.4 Population pairw ise F st values（below diagonal）and gene flow（N m）（above diagonal）of populations based on Cytb and COⅠgene sequences

表5 中性檢驗結(jié)果（包含P值）Tab.5 Results of neutrality tests（including associated P values）

圖1 基于Cytb基因的鰹群體核苷酸不配對分布Fig.1 M ismatch distribution graphs of populations based on Cytb gene sequences

2.4 鰹群體的系統(tǒng)進化關(guān)系

基于Cytb以及COⅠ基因單倍型序列利用Network繪制網(wǎng)絡(luò)圖（median-joining network，MJ網(wǎng)絡(luò)圖），如圖3和圖4所示?；贑ytb基因的MJ網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)H61和H78是主要的核心單倍型，通過單一突變或多步突變相連，且3個區(qū)域單倍型間彼此相互關(guān)聯(lián)，不存在與3個區(qū)域?qū)?yīng)的獨立單倍型，這也證明了3個區(qū)域群體間不存在顯著的分化。在基于COⅠ基因的MJ網(wǎng)絡(luò)圖中，H1是唯一的核心單倍型，且網(wǎng)絡(luò)圖呈放射狀分布，這與之前的種群擴張模式相一致，可驗證種群擴張事件的發(fā)生。

圖2 基于COⅠ基因的鰹群體核苷酸不配對分布Fig.2 M ismatch distribution graphs of populations based on COⅠgene sequences

圖3 鰹Cytb基因單倍型的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 M edian-joining network of Cytb gene hap lotypes of K.pelam is

圖4 鰹COⅠ基因單倍型的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 M edian-joining network of COⅠgene hap lotypes of K.pelam is

3 討論

本研究中，兩兩群體間Fst分析結(jié)果表明，3個群體間不存在顯著分化（Fst＜0.05，P＞0.05），存在頻繁的基因交流（Nm＞1），這與陳瑩等［8］的研究結(jié)果一致（采樣區(qū)域：164.80°E～172.44°E，7.71°S～3.53°N；使用線粒體DNA序列為Cytb和D-loop）。鰹是高度洄游的大洋性魚類［24］，運動能力強、活動范圍廣、有較為集中的產(chǎn)卵場，不同區(qū)域群體間有足夠的機會進行基因交流，這可能是導(dǎo)致群體間的分化不明顯的原因。FUJINO［25］的研究也表明，由于鰹隨著海流的運動及其洄游行為，中西太平洋的鰹亞種群可能屬于同一個產(chǎn)卵地洄游群體?；贑ytb以及COⅠ基因構(gòu)建的MJ單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中均出現(xiàn)了核心單倍型，其中基于COⅠ基因構(gòu)建的MJ單倍型網(wǎng)絡(luò)圖表現(xiàn)為一個星狀圖譜，且僅有一個核心單倍型H1，其他單倍型均以H1單倍型為中心呈放射狀分布，表明這3個群體可能來源于一個共同的祖先，證實了FUJINO［26］關(guān)于中西太平洋鰹為一個亞種群的研究結(jié)果。值得關(guān)注的是，基于Cytb以及COⅠ基因單倍型序列的網(wǎng)絡(luò)圖存在較大的差異，且基于兩者的Hd和Pi值也在不同區(qū)域間顯示出了明顯的差異，這可能是由于不同基因片段進化速率不同導(dǎo)致的［18-21］。

Cytb和COⅠ基因序列中G的含量均明顯低于其他3種堿基的含量，核苷酸的組成明顯偏離G，可能與密碼子位點的偏倚性和不均一性有關(guān)［27］，這與硬骨魚類核苷酸基本組成特征相符合［28］。遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，基于Cytb和COⅠ基因序列測得的單倍型多樣性指數(shù)（Hd）都極高，而核苷酸多樣性指數(shù)均較低，這可能是因為鰹群體在歷史上存在迅速擴張的時期，單倍型多樣性隨著鰹數(shù)量的快速增加而變大，但核苷酸產(chǎn)生的變異沒有足夠的時間來積累，所以呈現(xiàn)高Hd低Pi的特征［7］。而基于兩段基因序列的中性檢驗和核苷酸錯配分布曲線也證實了鰹可能在末次冰期（約于7萬年前開始，于1.15萬年前完結(jié)）［29］經(jīng)歷快速的群體擴張事件。第四紀(jì)海平面變動的控制因素是冰川作用，隨冰期-間冰期的交替，海平面脈動降升［30-31］，本研究基于Cytb基因推算的鰹群體擴張時間（7.88萬年前）與末次冰期初期的海平面上升（7萬年前達到最高）時間吻合；隨后海平面隨著冰期與間冰期的交替不斷升降并于3.5萬年前再次達到最高［32］，大致接近現(xiàn)在位置，而基于COⅠ基因推算的鰹群體擴張時間正發(fā)生在6.74萬年～2.25萬年前。由此，推測中西太平洋鰹種群的擴張極有可能與海平面的快速上升（海侵）有關(guān)。

4 小結(jié)

本研究結(jié)合兩種分子標(biāo)記對中西太平洋的鰹群體遺傳結(jié)構(gòu)進行研究，研究結(jié)果為鰹漁業(yè)資源的長期監(jiān)測評估提供了重要依據(jù)。研究表明3個區(qū)域間鰹群體不存在顯著的遺傳分化，建議將中西太平洋不同區(qū)域的鰹群體劃為一個種群進行管理，以便鰹資源更加合理的保護與開發(fā)利用。然而，由于Cytb和COⅠ序列作為線粒體的分子標(biāo)記，相對于龐大的基因組而言無法反映鰹整體的遺傳信息，對于準(zhǔn)確檢測群體遺傳結(jié)構(gòu)存在一定局限性。因此，中西太平洋是否存在相互獨立的鰹群體仍存在不確定性，需要利用基因組覆蓋面更廣的分子標(biāo)記對鰹群體遺傳結(jié)構(gòu)進行比較研究。此外，綜合考慮遺傳信息和海洋環(huán)境因素以及鰹生活史特征，將有助于在中西太平洋制定和實施有效的鰹漁業(yè)管理策略。