周旭凱，田玉紅*，董 菲，陸 苑，陳房姣

1廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院；2廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)部，柳州 545006

廣藿香Pogostemoncablin(Blanco) Benth.為唇形科刺蕊草屬植物，以干燥地上部用藥，是我國(guó)常用的芳香化濕類中藥，味辛，微溫，歸脾、胃、肺三經(jīng)，具有芳香化濁、開(kāi)胃止嘔、發(fā)表解暑的功效[1]。廣藿香除作為藥用外，從其中提取的廣藿香精油用途也十分廣泛，因其具有濃烈的香味，主要作為化妝品、定香劑和殺蟲(chóng)劑等日常生活用品的生產(chǎn)配料[2,3]。

廣藿香揮發(fā)性成分的提取一般采用水蒸氣蒸餾工藝，餾出液中的油相部分即為精油，主要成分為廣藿香醇、廣藿香酮[4]。在精油的生產(chǎn)過(guò)程中由于精油分子在蒸餾過(guò)程中與水蒸氣保持長(zhǎng)時(shí)間接觸，所以精油中的極性和親水性成分部分地溶入水中，即為精油的水溶性揮發(fā)成分[5]。這部分微溶于水的揮發(fā)性成分，靠單純的力學(xué)手段是不可能將它們充分分離的，而且微溶于水的這部分精油，由于餾出液的油水比小，水溶性揮發(fā)成分在整個(gè)餾出精油中所占的比例是相當(dāng)可觀的。精油植物具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗癌、驅(qū)蚊等多種作用機(jī)制[6]，目前有關(guān)廣藿香精油的生物活性的研究報(bào)道還不多。本文提取了廣藿香揮發(fā)成分的油相部分和水溶性部分，采用GC-MS進(jìn)行化學(xué)成分分析，并對(duì)其清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為綜合開(kāi)發(fā)利用廣藿香資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

廣藿香購(gòu)自桂林鼎康中藥飲片有限公司，產(chǎn)地廣西，檢驗(yàn)結(jié)果符合2015版《中國(guó)藥典》一部標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2，2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基(DPPH·)(AR，美國(guó)Sigma公司)；2，2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽自由基(ABTS+·)(AR，美國(guó)Adamas公司)；過(guò)硫酸鉀(K2SO5)(AR，西隴科學(xué)股份有限公司)；叔丁基對(duì)苯二酚(tert-butylhydroquinone,TBHQ)(AR，美國(guó)Sigma公司)；丁基羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)(AR，美國(guó)Sigma公司)；廣藿香醇(patchouli alcohol)(97%，上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司)；廣藿香酮(pogostone)(98%，上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司)；氯化鈉(NaCl)(AR，廣東光華科技股份有限公司)；乙醚(C4H10O)(AR，四川西隴化工有限公司)；乙醇(C2H6O)(AR，臺(tái)山市粵僑試劑塑料有限公司)。

TRACE1300-ISQ QD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；HP-5石英毛細(xì)色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；1788揮發(fā)油提取器(湖州申玻儀器有限公司)；722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 廣藿香揮發(fā)性成分的提取

廣藿香揮發(fā)性成分油相部分的提取 準(zhǔn)確稱取100 g已搗碎的廣藿香，放置于2 000 mL燒瓶中，加入十倍量的水后連接揮發(fā)油提取裝置，采用水蒸氣蒸餾法提取6 h，靜止分層后讀取精油的體積為1.34 mL，稱重為1.31 g，提取率為1.31%。所得的廣藿香精油為淡黃色油狀液體。

廣藿香揮發(fā)性成分水溶性部分的提取 將蒸餾后燒瓶中的剩余殘液過(guò)濾，再次進(jìn)行蒸餾，收集餾出液。將餾出液用NaCl鹽析后用無(wú)水乙醚萃取，50 ℃水浴回收乙醚，獲取具有芳香氣味的棕黃色油狀液體即為水溶性揮發(fā)成分，稱重為0.68 g，提取率為0.68%。

1.2.2 GC-MS分析

采用GC-MS對(duì)廣藿香揮發(fā)性成分的油相成分和水溶性成分進(jìn)行定性定量分析[7]。氣相色譜條件：HP-5毛細(xì)管色譜柱，規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm。載氣為高純氦氣，流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，分流比1∶150，進(jìn)樣口溫度280 ℃，接口溫度280 ℃。采用程序升溫：60 ℃保持5 min，升至260 ℃(2 ℃/min)，于260 ℃保持5 min，水溶性揮發(fā)成分溶劑延遲2 min。質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，電子倍增器電壓1.5 KV，質(zhì)量掃描范圍50～550 amu，全掃描方式。采用計(jì)算機(jī)對(duì)各峰質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST17標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)的檢索，僅對(duì)與NIST17標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)比的SI或RSI值大于850的物質(zhì)進(jìn)行探討，參考標(biāo)準(zhǔn)圖譜及質(zhì)譜裂解規(guī)律確定其化學(xué)成分。定量方法采用峰面積歸一法計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量。

1.2.3 DPPH·清除能力的測(cè)定

以無(wú)水乙醇作為溶劑，配制0.02 mg/mL的DPPH·溶液，避光保存。分別取等體積的樣品溶液與DPPH·溶液充分混勻，確定反應(yīng)時(shí)間為1 h，在517 nm處測(cè)定其吸光度Ai，以無(wú)水乙醇分別代替上述體系中的樣品溶液和DPPH·溶液測(cè)定其吸光度為Ac和Aj，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值[8]。以TBHQ和BHA作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH·清除能力的計(jì)算公式為：

式中：Ai為2 mL樣品溶液+2 mLDPPH·的吸光度值；Aj為2 mL樣品溶液+2 mL無(wú)水乙醇的吸光度值；Ac為2 mL無(wú)水乙醇+2 mL DPPH·的吸光度值。

1.2.4 ABTS+·清除能力的測(cè)定

將7 mmol/L的ABTS+·溶液和2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液混合，在常溫下避光保存24 h后得到ABTS+·母液，并用無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)其濃度，使其在734 nm處吸光度為0.70(±0.002)，獲得ABTS+·工作液。分別取等體積的樣品溶液與ABTS+·工作液混勻，避光6 min后測(cè)定其在734 nm處的吸光度值A(chǔ)i，以無(wú)水乙醇代替樣品溶液測(cè)定其吸光度A0，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值[9]。以TBHQ和BHA作為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS+·清除能力的計(jì)算公式為：

式中：A0為2 mL乙醇+2 mLABTS+·的吸光度值；Ai為2 mL樣液+2 mLABTS+·的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS分析結(jié)果

按“1.2.2”GC-MS測(cè)試條件對(duì)廣藿香揮發(fā)性成分的油相成分和水溶性成分進(jìn)行分析，得到2種組分的總離子流色譜圖。如圖1所示，廣藿香揮發(fā)性成分的油相組分經(jīng)鑒定確認(rèn)了29個(gè)組分的化學(xué)成分，占油相物質(zhì)總含量的84.36%，水溶性部分經(jīng)鑒定確認(rèn)了28個(gè)組分的化學(xué)成分，占水溶性部分總含量的40.72%，結(jié)果如表1，表中各物質(zhì)按照其從HP-5毛細(xì)管色譜柱中的流出順序排列。

圖1 廣藿香揮發(fā)性成分的油相組分(A)和水溶性組分(B)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of oil fraction of the volatile compounds(A) and water-soluble fraction of the volatile compounds(B) from Pogostemon cablin(Blanco)Benth.

表1 廣藿香的揮發(fā)性化學(xué)成分Table 1 Chemical constituents of volatile compounds from Pogostemon cablin (Blanco)Benth.

續(xù)表1(Continued Tab.1)

廣藿香揮發(fā)性成分經(jīng)鑒定，油相成分中醇類物質(zhì)的含量最高共6種占總峰面積的37.12%，碳?xì)浠衔锏臄?shù)量最多共15種占29.55%，酮類物質(zhì)4種占14.79%，環(huán)氧化物1種占2.33%，酸類物質(zhì)1種占0.53%，醛類物質(zhì)1種占0.03%，醚類物質(zhì)1種占0.01%。油相成分中廣藿香醇的含量最高為34.72%，其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的成分依次為廣藿香酮(12.02%)、δ-愈創(chuàng)木烯(7.53%)、西車烯(6.69%)、α-綠葉烯(3.20%)、β-綠葉烯(2.66%)、(-)-莎草奧酮(2.62%)、氧化石竹烯(2.33%)、(1R，4aS，6R，8aS)-8a，9，9-三甲基-1，2，4a，5，6，7，8，8a-八氫-1，6-亞甲基萘-1-醇(2.31%)、環(huán)苜蓿烯(2.04%)、α-愈創(chuàng)木烯(1.81%)、石竹烯(1.77%)。研究表明，廣藿香醇具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、殺蟲(chóng)、抗動(dòng)脈粥樣硬化、止吐、增白和鎮(zhèn)靜作用。由于含量相對(duì)較多，廣藿香醇在《中國(guó)藥典》中被作為分析廣藿香藥材和廣藿香油質(zhì)量的指標(biāo)成分[10,11]。相關(guān)研究表明廣藿香揮發(fā)性成分在組分上具有一定的相似性，但含量上具有較大差異。Godbol等[3]用GC-MS對(duì)廣藿香葉子中提取的精油進(jìn)行分析，共鑒定出19種化合物，主要為廣藿香醇(30.65%)、α-愈創(chuàng)木烯(10.67%)、β-愈創(chuàng)木烯(9.09%)、石竹烯(8.64%)、二十碳烯(5.27%)。Verma等[5]對(duì)廣藿香地上部分(葉，花序和整個(gè)地上部分)的油進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)主要成分是廣藿香醇(42.2%～57.7%)、α-亞麻油(9.0%～15.2%)、α-愈創(chuàng)木烯(6.4%～17.9%)、西車烯(3.4%～6.9%)、廣藿香奧醇(0.3%～5.0%)和β-石竹烯(2.1%～3.6%)。Wang等[12]利用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)廣藿香揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析，鑒定出其中31個(gè)化學(xué)成分和各組分的相對(duì)含量，主要成分為廣藿香醇(31.66%)、廣藿香酮(23.58%)，其它成分是丁香烯、廣藿香烯、愈創(chuàng)木烯、法尼醇及它們的異構(gòu)體等。這可能是由于生長(zhǎng)環(huán)境、氣候條件的差異性所造成的。

鑒定的廣藿香水溶性揮發(fā)成分中除2-乙酰基吡咯(0.12%)和3-乙基-4-甲基-1H-吡咯-2,5-二酮(0.27%)2種含量極少的含氮化合物外，其余成分皆為含氧化合物，水溶性成分缺乏疏水性，因而不含萜烯類化合物[13]。水溶性揮發(fā)成分中酮類物質(zhì)9種占29.64%，酸類物質(zhì)5種占6.46%，醇類物質(zhì)4種占2.60%，醛類物質(zhì)6種占1.30%，酚類物質(zhì)2種占0.42%，含氮化合物2種占0.39%，環(huán)氧化物1種占0.18%。相對(duì)含量較高的成分有廣藿香酮(21.89%)、紫堇酮(5.76%)、異己酸(2.69%)、己酸(2.09%)，由此可見(jiàn)廣藿香揮發(fā)性成分的水溶性成分與油相成分相差很大。相關(guān)研究也表明，從植物中提取的水溶性組分和油相組分的化學(xué)成分不僅在數(shù)量上不同，而且往往在質(zhì)量上也不同[14,15]。廣藿香揮發(fā)性成分的水溶性成分中富含廣藿香酮，并且其中廣藿香酮(21.89%)的含量高于油相中廣藿香酮(12.02%)的含量。廣藿香酮是重要的醫(yī)藥及日化原料，作為廣藿香精油的重要組成成分，具有一定的抗氧化作用，因此在化妝品行業(yè)有較好的前景。除此之外廣藿香酮還具有顯著的抗菌、抗炎、抗病原微生物、抗腫瘤、殺蟲(chóng)等作用[16]。

2.2 廣藿香揮發(fā)性成分對(duì)DPPH·的清除效果

DPPH·有單電子，在517 nm處有強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收減弱，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系。圖2為不同濃度下廣藿香揮發(fā)性成分油相成分、水溶性成分、廣藿香醇、廣藿香酮以及兩種抗氧化劑TBHQ和BHA對(duì)DPPH·的清除率。由圖2可知，隨著樣品濃度的增大其對(duì)DPPH·清除效果也隨之增強(qiáng)，不同濃度下廣藿香揮發(fā)性成分油相成分和水溶性成分對(duì)DPPH·的清除效果呈現(xiàn)量效關(guān)系。表2所示，實(shí)驗(yàn)條件下，反應(yīng)時(shí)間為1 h時(shí)，廣藿香揮發(fā)性成分油相成分和水溶性成分清除DPPH·的IC50值分別為6.489 9和0.187 0 mg/mL，廣藿香醇、廣藿香酮清除DPPH·的IC50值分別為8.318 3和5.491 7 mg/mL。

圖2 DPPH·的清除率與濃度之間的關(guān)系Fig.2 DPPH·radical scavenging rate of essential oils at different concentration注：A.廣藿香揮發(fā)性成分的油相成分；B.廣藿香揮發(fā)性成分的水溶性成分；C.廣藿香醇；D.廣藿香酮；E.叔丁基對(duì)苯二酚；F.丁基羥基茴香醚，下同。Note：A.Oil fraction of the volatile compounds from P.cablin;B.Water-soluble fraction of the volatile compounds from P.cablin;C.Patchouli alcohol;D.Pogostone;E.tert-Butylhydroquinone;F.Butylated hydroxyanisole,the same below.

2.3 廣藿香揮發(fā)性成分對(duì)ABTS+·的清除效果

ABTS+·是一種具有特殊藍(lán)綠色且性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的水溶性自由基，可通過(guò)K2S2O8氧化ABTS+·獲得。其與具有抗氧化能力的樣品反應(yīng)可使溶液顏色逐漸變淺至無(wú)色，且褪色的程度越明顯則其抗氧化能力越強(qiáng)，其特征吸光度值越小[17]。圖3為不同濃度下廣藿香揮發(fā)性成分油相成分和水溶性成分對(duì)ABTS+·的清除率。由圖3可知，廣藿香揮發(fā)性成分油相成分和水溶性成分對(duì)ABTS+·的清除率均隨樣品濃度的增大而增大。表2所示，實(shí)驗(yàn)條件下廣藿香揮發(fā)性成分油相成分和水溶性成分清除ABTS+·的IC50值分別為0.998 5和4.662×10-2mg/mL，廣藿香醇、廣藿香酮清除ABTS+·的IC50值分別為2.126 5和16.283 8 mg/mL。表明廣藿香揮發(fā)性成分的水溶性成分清除ABTS+·的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于油相成分，且油相成分和水溶性成分抗氧化能力強(qiáng)于其主要成分廣藿香醇和廣藿香酮。

圖3 ABTS+·的清除率與濃度之間的關(guān)系Fig.3 ABTS+·radical scavenging rate of essential oils at different concentration

表2 廣藿香揮發(fā)性成分的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of volatile components of Pogostemon cablin (Blanco)Benth.

相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，植物揮發(fā)性成分的水溶性成分的抗氧化能力優(yōu)于油相成分，Rania等[15]采用DPPH·清除法和β-胡蘿卜素法的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金盞花的水溶性揮發(fā)成分的抗氧化能力大大強(qiáng)于油相成分。Sanja等[18]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)從天竺葵莖和葉子中提取的水溶性揮發(fā)成分清除DPPH·的能力也優(yōu)于油相成分。Shen等[19]發(fā)現(xiàn)檳榔和椰子的花、莖、根的水溶性揮發(fā)成分對(duì)DPPH·和ABTS+·均有良好的清除作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示水溶性揮發(fā)成分的抗氧化能力與酚的含量密切相關(guān)，酚類物質(zhì)的含量越高，抗氧化能力越強(qiáng)。在鑒定確認(rèn)的廣藿香水溶性揮發(fā)成分中含有4-甲氧基苯酚和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚兩種酚類物質(zhì)，雖然含量較低，但在抗氧化活性中可能起著主要作用[20,21]。而在廣藿香揮發(fā)性成分的油相成分中不含酚類物質(zhì)，因此廣藿香水溶性揮發(fā)成分對(duì)DPPH·和ABTS+·的清除能力都強(qiáng)于油相成分，這也與相關(guān)的研究結(jié)果相符。

3 結(jié)論

分別提取了廣藿香揮發(fā)性成分的油相成分和水溶性成分，分別采用GC-MS聯(lián)用法進(jìn)行了定性定量分析。鑒定的廣藿香揮發(fā)性成分的油相成分中廣藿香醇的含量最高為34.72%，其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的成分依次為廣藿香酮(12.02%)、δ-愈創(chuàng)木烯(7.53%)、西車烯(6.69%)。與油相成分不同，鑒定確認(rèn)的水溶性成分中主要為含氧化合物，不含萜烯化合物，主要成分為廣藿香酮(21.89%)、紫堇酮(5.76%)。通過(guò)DPPH·清除法和ABTS+·清除法測(cè)定出廣藿香揮發(fā)性成分中的油相成分和水溶性成分均具有較好的清除自由基的活性，研究結(jié)果還表明水溶性揮發(fā)成分對(duì)DPPH和ABTS自由基清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于油相成分。綜上所述，作為天然自由基清除劑和抗氧化劑來(lái)源，廣藿香揮發(fā)性成分在食品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)中具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。