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        連樸飲防治慢性萎縮性胃炎的作用機理研究

        2020-11-10 03:48:46呂文亮
        天然產(chǎn)物研究與開發(fā) 2020年10期
        關(guān)鍵詞:靶標萎縮性胃炎

        向 陽,戚 璐,呂文亮*

        1湖北中醫(yī)藥大學(xué),武漢 630065;2生物資源保護與利用湖北省重點實驗室;3湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部,恩施 445000

        連樸飲首見于清代醫(yī)家王孟英所著《霍亂論》,又名王氏連樸飲。初為治療濕熱霍亂而設(shè),《霍亂論·卷下》載:“治濕熱蘊伏而成濕熱霍亂,兼能行食滌痰”[1],方由黃連、厚樸、半夏、石菖蒲、淡豆豉、蘆根、梔子七味中藥組成,具有清熱化濕,理氣和中之功效,其證多見濕熱蘊伏、霍亂吐利、胸脘痞滿、口渴心煩,小便短赤,苔黃膩等。王氏曾言:“諸郁之發(fā),必從熱化。土郁者,中焦?jié)袷?,而升降之機乃窒”[2],故后世醫(yī)家多基于此,利用連樸飲開郁化濁、升降氣機之功,化裁治療濕熱并重、困阻中焦的內(nèi)科雜病。

        慢性萎縮性胃炎是由多種原因引起的胃組織黏膜的慢性炎性反應(yīng),屬于消化系統(tǒng)常見病之一[3]。依據(jù)臨床癥狀表現(xiàn)可歸于中醫(yī) “胃脘痛”、“痞滿”、“反酸”、“嘈雜”等范疇?,F(xiàn)代研究認為H.pylori感染是慢性萎縮性胃炎發(fā)生的最主要病因,此外膽汁反流、長期服用NSAIDs等藥物和乙醇攝入是慢性胃炎相對常見的病因[4]。由于該病機理復(fù)雜,病情容易反復(fù)發(fā)作,抗炎和根除幽門螺桿菌的治療方式又具有很大的局限性,由慢性非可控性炎癥向癌癥惡性轉(zhuǎn)化的“炎-癌轉(zhuǎn)化”模式,越來越受到人們的廣泛關(guān)注。2017年中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會將連樸飲列為防治慢性萎縮性、非萎縮性胃炎脾胃濕熱證的推薦方劑[3,4],雖然連樸飲的臨床療效得到肯定,但其作用機理尚不明晰,本研究旨在運用現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對連樸飲防治慢性萎縮性胃炎“炎癌轉(zhuǎn)化”作用機理進行探討,并利用分子對接技術(shù)進行初步驗證,為今后的研究提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 連樸飲中藥成分與靶標篩選

        利用TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫檢索連樸飲方中7味中藥(黃連、厚樸、半夏、梔子、石菖蒲、蘆根、淡豆豉)的活性成分,并進行靶標預(yù)測,設(shè)定口服生物了利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18為篩選條件建立中藥成分數(shù)據(jù)庫;下載中藥活性成分的MOL2格式文件,經(jīng)AutoDock1.5.6軟件處理、轉(zhuǎn)換為pdbqt文件保存用于分子對接實驗;同時,檢索獲取所有成分的作用靶標,上傳至Uniprot數(shù)據(jù)庫進行靶標-基因名稱轉(zhuǎn)換保存?zhèn)溆?。在GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM Gene Map(https://www.omim.org/search/advanced/geneMap)數(shù)據(jù)庫中以“chronic atrophic gastritis”為關(guān)鍵詞獲取慢性萎縮性胃炎的相關(guān)基因,合并數(shù)據(jù)集并去重后與轉(zhuǎn)換后的中藥靶標取交集,作為共有靶標,并利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具繪制韋恩圖。

        1.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

        將共有靶標導(dǎo)入STRING11.0(https://string-db.org/)平臺進行蛋白互作分析,設(shè)定物種為Homo sapiens,置信度大于0.9進行篩選,隱藏離散節(jié)點,制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖;下載tsv文件,導(dǎo)入Cytoscape 3.6.2軟件,結(jié)合MCODE插件進行靶標聚類,篩選與免疫、炎癥相關(guān)的核心聚類靶標用于分子對接;同時構(gòu)建中藥-成分-靶標-疾病網(wǎng)絡(luò),并對網(wǎng)絡(luò)圖拓撲值進行計算,按度值、介度中位數(shù)值的2倍卡值篩選獲得中藥化合物核心節(jié)點。

        1.3 基因本體、通路分析及分子對接驗證

        將共有靶標輸入DAVID6.8在線平臺(https://david.ncifcrf.gov/conversion.jsp)獲取靶點蛋白ID,借助R(clusterProfiler包)進行基因本體、KEGG信號通路分析,據(jù)P≦0.05進行分析,取P-value值最小前20條目制圖,并根據(jù)富集結(jié)果抽取與免疫、炎癥相關(guān)的信號通路分析其作用機理。在PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫以Homo sapiens來源檢索獲取核心靶標的晶體結(jié)構(gòu),借助AutoDockTool、Vina軟件與化合物進行分子對接,搜集分析結(jié)合能(kcal/mol)值,佐證連樸飲防治慢性萎縮性胃炎的合理性。

        2 結(jié)果

        2.1 連樸飲中藥活性成分及靶標篩選結(jié)果

        從TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)黃連活性成分58個、厚樸139個、半夏116個、石菖蒲105個、梔子98個、淡豆豉15個、蘆根31個,按照OB≧30%且DL≧0.18條件篩選最終獲得中藥活性成分共45種(見表1),獲取作用靶標193個;從GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶標686個;將所有中藥靶標通過Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換后與疾病靶標取交集,獲得共有靶標81個(見圖1)。

        續(xù)表1(Continued Tab.1)

        圖1 藥物與疾病共同靶標韋恩圖Fig.1 Venn diagram of common targets for drugs and disease

        2.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及蛋白互作結(jié)果

        通過STRING11.0平臺分析獲得靶標蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖2),其中節(jié)點164個、邊269條、平均節(jié)點度:6.64、平均局部聚類系數(shù):0.442;利用Cytoscape 3.6.2軟件的MCODE插件對該網(wǎng)絡(luò)圖進行聚類分析得到4個子網(wǎng)絡(luò),據(jù)得分最高創(chuàng)建核心靶標網(wǎng)絡(luò)圖(圖3),核心靶標網(wǎng)絡(luò)(得分6.909)中的節(jié)點有:原癌基因c(proto-oncogene c-Fos,F(xiàn)OS)、細胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)、白細胞介素1β(interleukin-1 beta,IL1B)、白介素6(interleukin-6,IL6)、白介素10(interleukin-10,IL10)、C-C基序趨化因子2(c-c motif chemokine 2,CCL2)、C-X-C基序趨化因子2(c-x-c motif chemokine 2,CXCL2)、轉(zhuǎn)錄因子p65(transcription factor p65,RELA)、絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、干擾素γ(interferon gamma,IFNG)、白介素8(interleukin-8,CXCL8),該核心聚類與免疫炎癥關(guān)系最為密切,故作為后續(xù)分子對接的核心靶標。以共有靶標構(gòu)建中藥-成分-靶標-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(圖4),圖中三角形節(jié)點代表慢性萎縮性胃炎,橢圓形節(jié)點代表作用靶標,菱形節(jié)點代表活性成分,箭頭節(jié)點代表藥物。經(jīng)NetworkAnalyzer工具計算該網(wǎng)絡(luò)度值中位數(shù)為4,介度中位數(shù)為0.000 389 87,按度值、介度中位數(shù)值的2倍卡值篩選獲得中藥化合物核心節(jié)點(表2),提示這些化合物是連樸飲的主要活性成分。

        表2 主要活性成分信息Table 2 Main active ingredient information

        圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of protein-protein interaction

        圖3 核心靶標網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Core target network diagram

        圖4 中藥-成分-靶標-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Traditional chinese medicine-ingredient-target-disease network

        2.3 靶標基因本體、信號通路富集結(jié)果

        通過基因本體(GO)富集分析發(fā)現(xiàn)連樸飲防治慢性萎縮性胃炎的生物學(xué)作用可能主要涉及細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、受體配體活性、激酶調(diào)節(jié)活性等,取P-value值前20條目制圖如圖5所示,圖中泡泡節(jié)點的顏色由藍到紅漸變代表P-value值越小,節(jié)點由小到大漸變代表富集靶標數(shù)量越多。通過KEGG信號通路富集分析,P-value最小前20條目如圖6所示,圖中泡泡節(jié)點的顏色由藍到紅漸變代表P值越小,節(jié)點由小到大漸變代表富集靶標數(shù)量越多。抽取結(jié)果中與免疫、信號傳導(dǎo)相關(guān)的信號通路有:IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、C型凝集素受體信號通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、Th17細胞分化(Th17 cell differentiation)信號通路,這些信號通路與靶標相互關(guān)系如圖7所示,提示這些信號通路和靶標與慢性萎縮性胃炎“炎癌轉(zhuǎn)化”作用密切相關(guān)。

        圖5 GO富集結(jié)果信息(top 20)Fig.5 GO enrichment result information(top 20)

        圖6 KEGG信號通路富集結(jié)果信息(top 20)Fig.6 KEGG signal pathway enrichment result information(top 20)

        圖7 與免疫炎癥相關(guān)的主要信號通路與靶標的映射信息Fig.7 Mapping information of major signaling pathways and targets related to immune inflammation

        2.4 分子對接結(jié)果

        核心靶標FOS、ICAM1、IL1B、IL6、IL10、CCL2、CXCL2、RELA、MAPK8、MAPK1、IFNG、CXCL8在PDB數(shù)據(jù)庫檢索獲取得到的晶體結(jié)構(gòu)ID依次為:1A02、1IAM、1I1B、1ALU、1ILK、1DOK、5OB5、3QXY、3ELJ、1PME、1FYH、1ICW,通過與核心活性成分進行分子對接,搜集Vina對接的結(jié)合能(kcal/mol)數(shù)值見表3所示,實驗結(jié)果顯示連樸飲核心成分與核心靶標分子對接的結(jié)合能數(shù)值均為負,提示核心靶標與主要活性成分均具有很好的結(jié)合性。

        表3 分子對接得分信息Table 3 Molecular docking score information

        3 討論

        慢性胃炎是有多種病因引起的胃粘膜慢性炎癥反應(yīng)[5],是臨床常見病和多發(fā)病。由于該病慢性遷延的發(fā)病過程,并且由慢性萎縮伴腸上皮化生到內(nèi)瘤變最終演化為惡性癌癥的風(fēng)險較高,慢性胃炎-慢性萎縮性胃炎-胃癌轉(zhuǎn)化的“炎癌轉(zhuǎn)化”的模式越來越受到人們的普遍關(guān)注。近些年,課題組在“病證結(jié)合”模式下,借助代謝組學(xué)等技術(shù)方法證實慢性萎縮性胃炎中醫(yī)病機存在由濕熱致虛、再由濕熱致瘀的總體轉(zhuǎn)化趨勢,提出了清熱利濕、活血化瘀的治法[6]。連樸飲做為脾胃濕熱證的代表方劑,臨床研究發(fā)現(xiàn)以連樸飲為主方加減在改善慢性胃炎伴糜爛脾胃濕熱證的臨床癥狀、內(nèi)鏡下黏膜表現(xiàn)、Helicobacterpylori根除率方面療效確切[7]。連樸飲與針刺結(jié)合西藥對胃痞病脾胃濕熱型的臨床療效顯著[8]。在實驗研究方面,有研究證實連樸飲可下調(diào)胃癌前病變大鼠胃黏膜IL-6、NF-κB水平的表達,可以減少胃黏膜的炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)胃黏膜細胞增殖與凋亡的失衡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)IL6及NF-κB信號通路中關(guān)鍵因子RELA、IL1B、CXCL8、CXCL2均是連樸飲防治慢性萎縮性胃炎的核心靶標,從文獻的角度驗證了本研究的可靠性。

        連樸飲為中醫(yī)苦泄法的代表方劑,方中黃連性味苦寒,入心、肝、胃大腸經(jīng)可燥熱泄?jié)?,現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實黃連所含主要成分小檗堿對慢性萎縮性胃炎的主要致病菌(H.pylori)具有較強抑制作用[8,9];厚樸性味苦辛溫,可行氣化濕,滌痰通滯,基于系統(tǒng)藥理學(xué)的厚樸藥理作用機制研究認為,厚樸主要成分皂苷類化合物、生物堿及揮發(fā)油等成分可以對胃腸動力、炎癥等起到重要的調(diào)節(jié)作用[10];黃連與厚樸相配既能通降濕熱,又可升降氣機,共為君藥。豆豉苦寒入肺胃,可宣發(fā)郁熱,有研究發(fā)現(xiàn)豆豉主要成分黃豆黃素對人胃癌細胞有明顯的細胞毒作用,其作用機制可能與激活MAPK,抑制STAT3及NF-κB信號通路有關(guān)[11];梔子苦寒清熱,瀉三焦火熱,有研究認為梔子所含槲皮素可能通過影響p38MAPK、BCL-2和BAX的水平,防止幽門螺桿菌感染引起的胃炎和凋亡[12];石菖蒲辛溫,芳香化濁、開竅豁痰、理氣祛濕,Rahamooz等[13]發(fā)現(xiàn)石菖蒲活性成分可引起胃癌細胞起到阻滯和下調(diào)Oct4和NS基因的作用,能抑制HUVECs細胞的血管生成;半夏辛溫,燥濕溫中、理氣化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié),所含β-谷甾醇能抑制胃癌細胞增殖并促進其凋亡,其機制可能與通過PI3K/AKT/mTOR通路誘導(dǎo)細胞自噬作用有關(guān)[14];蘆根甘寒,清熱利濕、生津止渴,研究發(fā)現(xiàn)所含豆甾醇在胃癌細胞SNU-1中,能上調(diào)BAX、下調(diào)BCL-2的表達、抑制癌細胞增殖和遷移,以及抑制JAK/STAT信號通路[15]。縱觀連樸飲全方,體現(xiàn)了分解濕熱、以及“宣上、暢中、滲下”的治療思想,為臨床防治慢性萎縮性胃炎的運用提供了參考依據(jù)。

        本研究利用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法,搜集連樸飲活性成分與靶標信息構(gòu)建了成分靶標網(wǎng)絡(luò),通過PPI、GO、KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)其作用機制涉及多種生物學(xué)過程和多條信號通路,其中與慢性萎縮性胃炎“炎癌轉(zhuǎn)化”相關(guān)的代表性的免疫炎癥信號通路有:IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、Th17細胞分化信號通路等。目前研究證實白介素17信號通路在急性和慢性炎癥反應(yīng)中都扮演著重要的角色,其家族信號(IL-17A-F組成)通過其相應(yīng)的受體,激活下游通路,包括NF-kB、MAPKs和C/EBPs,誘導(dǎo)抗菌肽、細胞因子和趨化因子的表達[16,17],IL-17F 6400A/G基因多態(tài)性與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生風(fēng)險顯著相關(guān)[18],而黃連素可能通過下調(diào)IL-6、IL-17的表達有效改善慢性萎縮性胃炎患者的臨床癥狀和病理分級[19],這也從側(cè)面證實連樸飲可能通過調(diào)節(jié)IL-17信號通路中相關(guān)信號因子的表達對慢性萎縮性起到治療作用。Thl7細胞主要介導(dǎo)慢性炎癥,在慢性萎縮性胃炎“炎癌轉(zhuǎn)化”過程中發(fā)揮著重要作用,有研究證實Th17/IL-17可以促進H.pylori感染后的細菌定植以及炎癥的程度[20,21],目前在連樸飲的臨床研究中發(fā)現(xiàn)連樸飲可對H.pylori感染陽性慢性胃炎具有顯著療效[22],其如何通過Th17細胞分化途徑調(diào)控慢性萎縮性胃炎“炎癌轉(zhuǎn)化”進程有待進一步研究。慢性萎縮性胃炎作為胃癌前病變,在“炎癌轉(zhuǎn)化”進程中多種促炎細胞因子(如IL-1β、IL-8、IL-11、TNF-α、IFN-γ等)發(fā)揮著重要的作用,同時涉及到多條免疫炎癥信號通路,如本次富集分析中發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路等,通過分子對接實驗發(fā)現(xiàn)連樸飲與這些關(guān)鍵靶標具有很好的結(jié)合性,但同時需要進一步的研究探討連樸飲對這些靶標與通路調(diào)控表達的具體機制。

        綜上所述,本次研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的技術(shù)方法,闡明了連樸飲活性成分、靶標、信號通路之間的相互作用,發(fā)現(xiàn)了多個靶標、信號通路等生物學(xué)過程,并進行了初步驗證,為今后的藥效機制實驗研究與臨床研究提供了參考依據(jù)。

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