許瓊梅,高 雅,李梓萌,韋日明,馬曉輝,晉 玲*,張可鋒*
1桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,桂林 5410041;2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,蘭州 730000
非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指排除酒精和其他明確的損肝因素所致的,以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征,與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和氧化應(yīng)激關(guān)系密切[1,2]。隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,NAFLD在我國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),遺傳、糖尿病、高脂飲食、運(yùn)動(dòng)缺乏等內(nèi)外因素都能誘發(fā)NAFLD[3]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,NAFLD由于氧化應(yīng)激及胰島素抵抗二次或多重打擊引起的,這一理念被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛認(rèn)同[4]。因此抗炎抗氧化等經(jīng)典策略可作為本病的基本治則。TLR-4/NF-κB信號(hào)通路是經(jīng)典的炎癥通路,該通路是對(duì)各種刺激引起肝臟變化最常見(jiàn)的通路[5]。TLR-4的激發(fā)通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活NF-κB,繼而促進(jìn)炎癥因子釋放,最終誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死并激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。抑制TLR-4/NF-κB信號(hào)通路的活化是減輕肝組織炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路,也是下調(diào)與氧化應(yīng)激有關(guān)的炎性表達(dá)的標(biāo)志。同時(shí),AMPK/Nrf2信號(hào)通路在體內(nèi)抵抗氧化應(yīng)激和改善脂質(zhì)沉積過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Nrf2是細(xì)胞防御系統(tǒng)抵抗氧化應(yīng)激的主要調(diào)節(jié)因子,有證據(jù)表明Nrf2的遺傳缺失與更嚴(yán)重的NAFLD相關(guān)[6]。AMPK是細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)和炎癥的中心調(diào)節(jié)劑,能夠調(diào)節(jié)脂肪酸生物合成,并抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[7]。由于Nrf2和AMPK在氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵作用,該通路可作為治療肝臟脂質(zhì)浸潤(rùn)和炎癥的潛在治療靶標(biāo)。同時(shí),已有研究表明AMPK/Nrf2通路可能是調(diào)節(jié)非酒精性脂肪肝發(fā)展進(jìn)程的關(guān)鍵通路[8]。
龍膽苦苷(gentiopicroside,GPS)是由龍膽科植物龍膽草中提取的裂環(huán)烯醚萜苷類[9,10],藥理研究表明GPS具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、清除自由基等臨床功效,其保肝利膽療效顯著[11],然而其保肝機(jī)制尚未明確。許多研究顯示GPS在抗病原微生物、胃腸道、胰腺、心血管疾病甚至呼吸系統(tǒng)疾病與神經(jīng)精神疾病等方面也有較大的應(yīng)用潛力[12]。同時(shí),GPS具有顯著抗氧化和保護(hù)肝臟的作用,并能促進(jìn)膽汁分泌和其他生物活性。有報(bào)道表明GPS對(duì)化學(xué)物質(zhì)和D-半乳糖胺/脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷小鼠具有保護(hù)作用[13]。另外,GPS可通過(guò)AMPK-PPARα信號(hào)通路改善酒精性脂肪肝病癥狀,但是目前關(guān)于NAFLD模型中GPS與TLR-4/NF-κB、AMPK/Nrf2信號(hào)通路之間的關(guān)聯(lián)的研究尚未報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠NAFLD模型,采用二甲雙胍作對(duì)照,初步研究GPS保護(hù)肝臟的作用及對(duì)TLR-4/NF-κB、AMPK/Nrf2信號(hào)通路的調(diào)控作用,為GPS用于臨床治療NAFLD提供依據(jù)。
雄性SD大鼠66只,體質(zhì)量200 ± 20 g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002。所有大鼠均飼養(yǎng)在溫度22 ± 2 ℃、濕度45%~50%、12 h光照/暗循環(huán)的環(huán)境下,自由獲取食物和水,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)1周。
GPS(南京道斯夫生物科技有限公司,純度>98%,批號(hào):181116A);高脂飼料(D12492,江蘇協(xié)同藥業(yè)生物工程有限公司);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、甘油三酯(TG)試劑盒(南京建成生物工程研究所);白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(Elabscience公司);RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(南通市碧云天生物技術(shù)研究所);NF-κBp-p65、NF-κBp65、AMPK、p-AMPK抗體、Nrf2抗體(美國(guó)CST);TLR-4抗體(英國(guó)Abcam);β-actin單抗(天錫傲銳東源生物科技有限公司);辣根酶標(biāo)志的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);Super ECL Plus超敏發(fā)光液(北京普利萊基因科技有限公司)。
H2050R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)廠);Epoch型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司);AUW220D型半微量電子天平(日本島津公司);O1ympus BX51型顯微鏡(日本奧林巴斯公司);THZ-C-1臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司);全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。
66只SD大鼠隨機(jī)均分為兩組:正常組(n=13)和高脂組(n=53)。正常組喂普通飼料,高脂組喂高脂飼料。喂養(yǎng)8周后,兩組各隨機(jī)抽取3只小鼠進(jìn)行病理檢查,評(píng)估NAFLD模型是否成功[14]。確定模型成功后,高脂組隨機(jī)均分為模型組、二甲雙胍組(200 mg/kg)和GPS高、中、低劑量(120、60、30 mg/kg)組,每組10只。模型組繼續(xù)喂高脂飼料,各用藥組在喂高脂飼料的同時(shí)灌胃相應(yīng)劑量的藥物,正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃,每天1次,共6周。14周末,禁食不禁水16 h,摘除眼球取血,收集肝臟,肝左葉置于4%多聚甲醛中固定,肝右葉-80 ℃保存。
靜置血液樣本2 h后置于高速冷凍離心機(jī)4 500 rpm,4 ℃離心15 min,收集血清。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定血清中ALT、AST、SOD、GSH-Px、MDA、TC、TG、LDL-C、HDL-C的活性或含量。
葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖(FBG),ELISA法檢測(cè)血清空腹胰島素(FINS)含量,胰島素抵抗指數(shù)按穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)(HOMA-IR)計(jì)算:HOMA-IR = FINS×FBG/22.5。
各取相同位置肝臟組織100 mg,加入磷酸鹽緩沖液研磨制成10%(W/V)肝組織勻漿,根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。
稱取各組大鼠肝葉相同部位約60 mg置于勻漿器中,加入RIPA裂解液于冰上研磨制成勻漿,離心后吸取上清液,嚴(yán)格按照BCA法測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行定量,煮沸后使其變性,貯存于-20 ℃冰箱中待用。制備電泳膠(10%的分離膠和5%的濃縮膠),用移液槍將變性蛋白和Marker加入上樣孔,進(jìn)行SDS-PAGE電泳(濃縮膠恒壓80 V,分離膠恒壓120 V)分離蛋白,于冰浴中300 mA、70 min條件下轉(zhuǎn)膜,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,再用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h,TBST洗滌3次后加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜;次日,二抗孵育2 h,ECL化學(xué)發(fā)光法顯色,全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯影,Quantity One 4.6軟件分析蛋白灰度值,并以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算各組AMPK、p-AMPK、Nrf2、NF-κBp-p65、NF-κBp65、TLR-4蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
根據(jù)油紅O染色方法,將肝臟冰凍切片,60%異丙醇浸洗2 min,油紅O工作液染色,蘇木精復(fù)染,甘油明膠封片。封片后光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝肝臟脂質(zhì)沉積情況。
與正常組相比,模型組中的ALT和AST活性明顯增高(P<0.01)。與模型組相比,二甲雙胍組和GPS各劑量組中ALT和AST活性均明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05),表明GPS對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用,結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 GPS對(duì)NAFLD大鼠血清中ALT、AST的影響Table 1 Effect on the serum ALT and AST of
與正常組比較,模型組大鼠肝組織中MDA含量明顯升高(P<0.01),SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,二甲雙胍組和GPS各劑量組能一定程度地降低NAFLD大鼠血清中MDA的含量(P<0.05或P<0.01),且提高SOD、GSH-Px的活性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),表明GPS保護(hù)肝臟可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān),結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 GPS對(duì)SOD、GSH-Px和MDA的影響Table 2 Effect of GPS on the serum SOD,GSH-Px and
與正常組相比,模型組中的TC、TG、LDL-C水平明顯增高,而HDL-C明顯降低(P<0.01),表明本實(shí)驗(yàn)建立的NAFLD動(dòng)物模型成功。與模型組相比,二甲雙胍組和GPS各劑量組均能不同程度地降低NAFLD大鼠的TC、TG和LDL-C水平,且提高HDL-C水平(P<0.05或P<0.01),說(shuō)明GPS能改善NAFLD大鼠的脂質(zhì)代謝從而保護(hù)肝臟。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 GPS對(duì)血清中TC、LDL-C、HDL-C、TG的影響Table 3 Effect of GPS on the serum TC,LDL-C,HDL-C and
與正常組相比,模型組中的FINS、FBG、HOMA-IR水平明顯增高(P<0.01)。與模型組比較,二甲雙胍組和GPS高、中劑量組FBG、FINS、HOMA-IR水平顯著降低(P<0.01),GPS低劑量組FBG水平顯著降低(P<0.01),F(xiàn)INS、HOMA-IR水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),表明GPS能改善NAFLD大鼠的胰島素抵抗水平。結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 GPS對(duì)胰島素抵抗的影響Table 4 The of GPS effects on insulin
與正常組比較,模型組大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,二甲雙胍和GPS各劑量組都能有效抑制NAFLD大鼠肝臟TNF-α、IL-1β和IL-6水平的升高(P<0.01或P<0.05),表明GPS能抑制炎癥反應(yīng)從而保護(hù)肝臟。結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 GPS對(duì)肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6的影響Table 5 Effect of GPS on the hepatic TNF-α,IL-1β and
與正常組比較,模型組大鼠肝組織中NF-κBp-p65、TLR-4水平顯著升高而AMPK、Nrf2水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較,二甲雙胍和GPS各劑量組都能有效抑制NAFLD大鼠肝臟NF-κBp-p65與TLR-4水平的升高,同時(shí)上調(diào)AMPK和Nrf2的表達(dá)水平(P<0.01或P<0.05),表明GPS能通過(guò)調(diào)控TLR-4/NF-κB及AMPK/Nrf2通路從而保護(hù)肝臟,結(jié)果見(jiàn)表6。
圖1 GPS對(duì)TLR-4/NF-κB及AMPK/Nrf2的影響Fig.1 Effect of GPS on TLR-4/NF-κB and AMPK/Nrf2注:A:正常組;B:模型組;C:二甲雙胍組;D:GPS低劑量組;E:GPS中劑量組;F:GPS高劑量組;下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Metformin group;D:GPS-low dose group;E:GPS-medium dose group;F:GPS-high dose group;The same below.
油紅O染色結(jié)果顯示,正常組(圖2A)大鼠無(wú)明顯脂滴和炎性浸潤(rùn),模型組(圖2B)大鼠肝臟出現(xiàn)大面積的紅色脂肪滴,有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。二甲雙胍組(圖2C)和GPS各劑量組(圖2D-F)肝臟紅色脂滴明顯減少,炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
圖2 肝組織油紅O染色(200×)Fig.2 Liver tissue oil red O staining (200×)
近年來(lái)NAFLD的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢(shì),已成為慢性肝病及肝功能異常的主要病因之一[15]。目前用于治療NAFLD的相關(guān)藥物多數(shù)需要通過(guò)肝臟代謝,在治療NAFLD的同時(shí)也加重了肝臟的負(fù)擔(dān),而且藥物對(duì)NAFLD治療效果有限,尚未發(fā)現(xiàn)特異性較強(qiáng)的藥物[16],因此,尋找到療效確切且副作用小的藥物來(lái)治療NAFLD有較大的現(xiàn)實(shí)意義。
高脂飲食能引起血清中游離脂肪酸(FFA)增加,F(xiàn)FA在體內(nèi)不斷積累引起肝損傷,細(xì)胞膜通透性增高,導(dǎo)致細(xì)胞中ALT、AST溢出進(jìn)入血液[17]。模型組血清中ALT、AST的活性升高,伴隨著TC、TG、LDL-C含量上升,HDL-C含量下降,表明本實(shí)驗(yàn)成功建立NAFLD模型。研究結(jié)果顯示,GPS有效改善NAFLD,并對(duì)轉(zhuǎn)氨酶和血脂有調(diào)節(jié)作用,對(duì)肝臟起保護(hù)作用。
NAFLD的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚,目前“多重平行打擊”發(fā)病機(jī)理已被廣泛接受。炎癥、氧化應(yīng)激和胰島素抵抗等多種因素共同導(dǎo)致了NAFLD的發(fā)生與進(jìn)展[18,19]。IR為中心引起的肝臟脂肪浸潤(rùn)產(chǎn)生大量FFA,機(jī)體氧化途徑無(wú)法處理過(guò)量FFA則會(huì)導(dǎo)致TG增多,進(jìn)而引起脂肪堆積誘發(fā)脂肪變性[20]。同時(shí)FFA增多刺激肝臟枯否細(xì)胞分泌炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子TNF-α、IL-1β和IL-6,促進(jìn)炎癥的發(fā)生,導(dǎo)致肝細(xì)胞炎性浸潤(rùn)、壞死及纖維化的發(fā)生[21]。肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí),TLR-4與其配體結(jié)合激活NF-κB,從而引起一系列的炎性因子的合成和釋放,誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GPS高、中、低劑量組均能降低胰島素抵抗指數(shù)、TG、TC、LDL-C及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平,提高HDL-C水平,能夠有效抑制TLR-4及NF-κB信號(hào)通路,其中GPS高劑量組改善情況最明顯,提示GPS可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,調(diào)控TLR-4/NF-κB通路保護(hù)肝臟。
氧化應(yīng)激是非酒精性脂肪肝病公認(rèn)的損傷因素之一,肝細(xì)胞內(nèi)富含線粒體有利于氧化FFA,為細(xì)胞提供能量的同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生大量活性氧自由基[23]。機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)可以通過(guò)抑制自由基產(chǎn)生、清除自由基、修復(fù)損傷及誘導(dǎo)抗氧化酶發(fā)揮保護(hù)作用,SOD和GSH-Px為重要的抗氧化酶,能夠有效清除自由基,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)物形成,起到保護(hù)機(jī)體的作用[24]。MDA為自由基參與脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物,其異常表達(dá)可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),引起細(xì)胞腫脹、壞死[25]。AMPK的激活可促進(jìn)下游分子Nrf2的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,上調(diào)Nrf2的表達(dá)[26]。Nrf2通過(guò)調(diào)節(jié)因子發(fā)揮抗炎、抗氧化作用,介導(dǎo)下游多種抗氧化蛋白和酶如HO-1減輕肝臟氧化應(yīng)激[27]。本研究結(jié)果表明,與模型組比較,GPS各劑量組可明顯增強(qiáng)SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量,同時(shí)顯著增強(qiáng)p-AMPK、Nrf2蛋白表達(dá)水平,提示GPS可能激活A(yù)MPK/Nrf2信號(hào)通路,進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激從而達(dá)到保肝作用。
綜上所述,GPS可有效改善NAFLD大鼠損傷狀況,調(diào)節(jié)胰島素抵抗情況,抑制氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng),調(diào)控TLR-4/NF-κB和AMPK/Nrf2信號(hào)通路,為臨床應(yīng)用提供新策略。